PCR引物设计原则之个人心得篇

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PCR引物设计原则之个人心得篇
【字体：大中小】时间：2006年04月29日来源：生物
通
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摘要：
记得当初写本科论文，感到不知道讨论什么问题好。

愣是写了一大段的PCR条件摸索的讨论。

后来PCR成为实验最基本的一步了，但是发现在PCR 中还是有许多需要注意的地方。

PCR的第一步就是引物设计了。

引物设计需要注意的地方很多，在大多数情况下，我们都是在知道已知模板序列时进行PCR扩增的。

在某些情况比如构建文库的时候也会在不知道模板序列的情况下进行设计。

这个时候随机核苷酸序列就与模板不是完全匹配。

我们通常指的设计引物都是在已知模板序列的情况下进行。

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设计的目的是在两个目标间取得平衡：扩增特异性和扩增效率。

引物分析软件将试图通过使用每一引物设计变化的预定值在这两个目标间取得平衡。

设计引用有一些需要注意的基本原理：
①引物长度
一般引物长度为18~30碱基。

总的说来，决定引物退火温度（Tm值）最重要的因素就是引物的长度。

有以下公式可以用于粗略计算引物的退火温度。

在引物长度小于20bp时：[4(G+C)+2(A+T)]-5℃
在引物长度大于20bp时：62.3℃+0.41℃(%G-C)-500/length-5℃
另外有许多软件也可以对退火温度进行计算，其计算原理会各有不同，因此有时计算出的数值可能会有少量差距。

为了优化PCR反应，使用确保退火温度不低于54℃的最短的引物可获得最好的效率和特异性。

总的说来，每增加一个核苷酸引物特异性提高4倍，这样，大多数应用的最短引物长度为18个核苷酸。

引物长度的上限并不很重要，主要与反应效率有关。

由于熵的原因，引物越长，它退火结合到靶DNA上形成供DNA聚合酶结合的稳定双链模板的速率越小。

②GC含量
一般引物序列中G+C含量一般为40%~60%，一对引物的GC含量和Tm 值应该协调。

若是引物存在严重的GC倾向或AT倾向则可以在引物5’端加适量的A、T或G、C尾巴。

③退火温度
退火温度需要比解链温度低5℃，如果引物碱基数较少，可以适当提高退火温度，这样可以使PCR的特异性增加；如果碱基数较多，那么可以适当减低退火温度，是DNA双链结合。

一对引物的退火温度相差4℃～6℃不会影响PCR的产率，但是理想情况下一对引物的退火温度是一样的，可以在55℃～75℃间变化。

④避免扩增模板的二级结构区域
选择扩增片段时最好避开模板的二级结构区域。

用有关计算机软件可以
预测估计目的片段的稳定二级结构，有助于选择模板。

实验表明，待扩区域自由能（△G）小于58.6lkJ/mol时，扩增往往不能成功。

若不能避开这一区域时，用7-deaza-2’-脱氧GTP取代dGTP对扩增的成功是有帮助的。

⑤与靶DNA的错配
当被扩增的靶DNA序列较大的时候，一个引物就有可能与靶DNA的多个地方结合，造成结果中有多个条带出现。

这个时候有必要先使用BLAST 软件进行检测，网址：/BLAST/。

选择Align two sequences (bl2seq)，如下图。

BLAST的使用方法也十分简单，如下图所示。

将引物序列粘贴到1区，将靶DNA序列粘贴到2区，这两者可以互换的，并且BLAST会计算互补、反义链等多种可能，所以不需要用户注意两条链是否都是有义链。

如果知道序列在数据库中的GI号也可以直接输入GI号，这样就不用粘贴一大段的序列了。

最后在3处点击Align就可以查看引物在靶DNA中是否有多个同源位点了。

可是使用BLAST还是有其不方便的地方。

因为它一次只能比较两条序列，那么一对引物就需要分开进行比对。

如果存在错配，还需要自己计算由于错配形成的片段长度有多大。

在下一篇中将介绍一个软件，可以直接将靶DNA和引物输入对产物片段进行预测。

⑥引物末端
引物3’端是延伸开始的地方，因此要防止错配就从这里开始。

3’端不应超过3个连续的G或C，因这样会使引物在G+C富集序列区错误引发。

3′端也不能有形成任何二级结构可能，除在特殊的PCR（AS-PCR）反应中，引
物3′端不能发生错配。

如扩增编码区域，引物3′端不要终止于密码子的第3位，因密码子的第3位易发生简并，会影响扩增特异性与效率。

⑦引物的二级结构
引物自身不应存在互补序列，否则引物自身会折叠成发夹状结构，这种二级结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合。

若用人工判断，引物自身连续互补碱基不能大于3bp。

两引物之间不应该存在互补性，尤应避免3′端的互补重叠以防引物二聚体的形成。

一般情况下，一对引物间不应多于4个连续碱基的同源性或互补性。

⑧为了下一步操作而产生的不完全匹配
5’端对扩增特异性影响不大，因此，可以被修饰而不影响扩增的特异性。

引物5′端修饰包括：加酶切位点；标记生物素、荧光、地高辛、Eu3+等；引入蛋白质结合DNA序列；引入突变位点、插入与缺失突变序列和引入一启动子序列等。

额外的碱基或多或少会影响扩增的效率，还加大引物二聚体形成的几率，但是为了下一步的操作就要作出适当的“牺牲”。

很多时候PCR只是初步克隆，之后我们还需要将目的片段亚克隆到各种载体上，那么就需要在PCR这个步骤为下一步的操作设计额外的碱基。

以下总结一些为了亚克隆所要设计的序列。

a 添加限制性内切酶酶切位点
添加酶切位点是将PCR产物进行亚克隆使用得最多的手段。

一般酶切位点是六个碱基，另外在酶切位点的5’端还需要加2～3个保护碱基。

但是不同的酶需要的保护碱基数目是不相同的，例如：SalⅠ不需要保护碱基，EcoRⅤ需要1个，NotⅠ需要2个，Hind Ⅲ3个。

其中，在原核表达设计引物时还
有一些小技巧，大家可以参考：《原核表达之实验前的分析》。

里面一些规则是所有表达都通用的。

有一种做法是在进行PCR反应的同时进行酶切，这样就需要注意一些内切酶在PCR反应中的酶切反应率，见附录。

不过这种方法虽然方便但并不推荐。

有时候，就是把PCR产物回收后酶切再与载体连接效果都不尽理想，同步进行会使出现问题的原因变得更加复杂。

一旦出现问题，分析起来更麻烦。

b LIC添加尾巴
LIC的全称是Ligation-Independent cloning，它是Navogen公司专门为其部分的pET载体而发明的一种克隆方法。

用LIC 法制备的pET 载体有不互补的12–15 碱基单链粘端，与目的插入片段上相应粘端互补。

扩增目的插入片段的引物5'序列要与LIC载体互补。

T4 DNA 聚合酶的3'→5'外切活性经短时间即可在插入片段上形成单链粘端。

由于只能由制备好的插入片段和载体互相退火形成产物，这种方法非常快速高效，而且为定向克隆。

c 定向TA克隆添加尾巴
在T载体刚出的时候大家都拍手称赞，真是方便，哪个小子脑子这么聪明想出来的。

但是后来人们发现TA克隆无法将片段定向克隆到载体中，所以后来Invitrogen推出了可以定向克隆的载体，它的一端含有四个突出的碱基GTGG。

因此在PCR引物设计时也要相应的加上与之互补的序列，这样片段就可以“有方向”了。

d In-Fusion克隆方法
这项技术是Clontech还属于BD的时候推出的，2004年在生物通可着实风光了一把，不但当选年度创新试剂还被大家投票为最受大家欢迎的试剂。

此技术就其步骤来说是及其方便的，不需连接酶，不需长时间的反应。

只要
在设计引物的时候引入一段线性化载体两端的序列，然后将PCR产物和线性化的载体加入到含有BSA的In-Fusion酶溶液中，在室温下放置半个小时就
可以进行转化了。

这种方法特别适合大批量的转化。

这里顺便提一下如果有什么技术给大家留下深刻影响，欢迎大家发email 推荐给生物通。

说不定你的推荐可以让它成为年度之星呢。

如果要加入额外的碱基总是或多或少会影响到整个PCR反应，比如在加入NotⅠ的酶切位点后整个引物的退火温度就会直线上升（它识别的是8个碱基，且全为GC），这样使另外一个引物的设计变得十分困难，因为一对引物间退火温度相差不宜太远。

因此上面提到许多设计原则在实际应用中往往难以做到都符合。

在碰到这些情况的时候，我们只能秉着“实践是检验真理的唯一标准”这一原则，要试一试才能知道能否行得通了。

（生物通谢菲）
PCR引物设计技巧
本帖被bbschief 从生命科学新干线移动到本区(2009-09-07)
自从1985年美国PE—Cetus公司的人类遗传研究室Mullis等发明了具有划时代意义的聚合酶链反应(PCP0 以来，PCR已经成为了分子生
物学领域最基本也是最重要的技术手段之-[ I。

然而能否找到一对合适的核苷酸片段作为引物，使其有效地扩增模板DNA序列，无疑决定着PCR的成败。

现在动物遗传育种早已进入了分子时代，在基因水平寻求影响动物遗传表型的新基因突显重要，因此引物设计无疑又成为了寻找新基因的重中之重。

1 引物的设计以及初步筛选
引物的设计与初步筛选基本上通过一些分子生物学软件和相关网站来完成的，目前运用软件Primer Premier 5 或美国whitehead 生物医学研究所基因组研究中心在因特网上提供的一款免费在线PCR引物设计程序Primer 3来设计引物，再用软件Oligo 6进行引物评估，就可以初步获得一组比较满意的引物。

但是对于初学者来说，运用软件和程序来设计引物好象无从着手，其实只要我们掌握了引物设计的基本原则和注意事项，所有问题便迎刃而解。

因为无论是软件还是程序，都是以这些基本原则和注意事项为默认标准来进行引物设计的。

所以，我们在进行引物设计的时候大可不必在软件和程序的参数上花费过多的时间来思考，如果没有特殊要求我们完全可以把一些参数设为默认值。

下面我们主要讨论一下引物设计的原则和注意事项。

①引物的长度一般为15-30 bp，最好在18~24 bp，因为太短易形成错配(False priming) 降低特异性，而太长也会降低特异性，并且降低产量[21。

②引物在模板内最好具有单一性，也就是说在模板内部没有错配。

特别是3’端，一定要避免连续4个以上的碱基互补错配。

③引物序列的GC 含量最好在40％一60％，且上下游引物序列GC含量的差异不要太大，3’端最后5个碱基最好不要富含GC，特别是连续3个的G或C。

④DNA双链形成所需的自由能△G，应该以5’端向3’端递减，3’端△G 最好不要高于9．0 keaf mol[31。

⑤避免形成稳定的引物二聚体(Dimer and Cross DimeO 和发夹结构(Hairpin)，△G高于4．5 keal／mol时易引发上述两种结构的产生。

⑥引物所在的模板区域应该位于外显子区，最好跨越一个内含子区，这样便于对扩增出来的片段进行功能鉴定和表型分析。

⑦如果以DNA为模板设计引物，产物长度在100—600 bp比较理想。

而以mRNA为模板设计引物时，产物长度在150—300 bp比较理想。

⑧5’ 端对PCR影响不太大，可以引进修饰位点和标记物[2]。

只要掌握了以上原则和注意事项，我们可以在软件和程序设计的一组引物中筛选出几对我们需要的目标引物。

Primer Premier 5和Oligo 6可以在/soft/下载，primer3的主页位置在http://www.gen 。

2 引物的二次筛选
引物的二次筛选是指在初次筛选出的几对引物中进一步筛选出适合我
们进行特异、高效PCR扩增的那对引物。

本步应注意以下两点，一是得到的一系列引物分别在Genebank中进行回检。

也就是把每条引物在比对工具(/blast/) 的blastnr中进行同源性检索，弃掉与基因组其它部分同源性比较高的引物，也就是有可能形成
错配的引物。

一般连续10 bp以上的同源有可能形成比较稳定的错配，特别是引物的3’端应避免连续5-6 bp的同源。

二是以mRNA为模板设计引物时要先利用生物信息学的知识大致判断外显子与内含子的剪接
位点(例如/GENESCAN.html的GENESCAN工具或者GeneParser软，然后弃掉正好位于剪接位点的引物。

3 引物的最终评估
当我们经过初次筛选和二次筛选后得到的那对引物便可以用于合成，合成后我们经过PCR扩增可以对引物进行最终的评估。

一是PCR扩增的特异性和效率。

经过PCR条件优化后能否获得特异性条带，即无目的条带之外的多余条带。

另外，PCR产物的量是否足够，即无不出带和条带很弱的现象。

二是以DNA为模板设计引物时，PCR扩增产物是否与预期PCR产物大小相当。

如果相差太大G 于100 b ，有可能是错配产物。

三是是否形成引物二聚体带。

我们结合引物最终评估和测序的结果可以对引物设计的成败做出鉴定，为我们以后进行引物设计积累宝贵经验。

4 用比较基因组学分离新基因时引物设计的注意事项
扩增已知基因时经过初次筛选和二次筛选后得到的引物基本上能够满
足要求，但是当运用比较基因组学分离新基因时，设计引物还应注意以下两点：①模板的选择。

如果以DNA为模板设计引物，首先在Gen ebank中找到与待
分离新基因同源的其它物种的该基因。

利用http://www.ncbi.nlm.nih.go v/blast/的Blast工具和/elustalw/的Clustalw工具
把已检索到的基因进行同源性比较，根据比
较基因组定位的原理，选择研究深入、标记稠密的人和哺乳动物(如小鼠)保守功能基因DNA序列设计引物[51，该引物区段要求在各物种间绝对保守，差异不要大于2 bp，特别是3’端必须完全同源。

如果以电脑克隆策略获得的待分离物种新基因的EST一重叠群为模板设计引物，要求ESTs与信息探针之间同源性大于80％，长度大于100 bp，并且避免在EST的并接部位和可能的外显子与内含子剪接位点处设计引物。

②引物序列最好位于相临的外显子区且至少距离外显子与内含子剪接
处25 bD以上，这样便于对扩增出来的片段进行功能鉴定和表型分析。

然而能否找到一对合适的核苷酸片段作为引物，使其有效地扩增模板DNA序列，无疑决定着PCR的成败。

现在动物遗传育种早已进入了分子时代，在基因水平寻求影响动物遗传表型的新基因突显重要，因此引物设计无疑又成为了寻找新基因的重中之重。

但是对于初学者来说，运用软件和程序来设计引物好象无从着手，其实只要我们掌握了引物设计的基本原则和注意事项，所有问题便迎刃而解。

因为无论是软件还是程序，都是以这些基本原则和注意事项为默认标准来进行引物设计的。

所以，我们在进行引物设计的时候大可不必在软件和程序的参数上花费过多的时间来思考，如果没有特殊要求我们完全可以把一些参数设为默认值。

下面我们主要讨论一下引物设计的原则和注意事项。

①引物的长度一般为15-30 bp，最好在18~24 bp，因为太短易形成错配(False priming) 降低特异性，而太长也会降低特异性，并且降低产量[21。

②引物在模板内最好具有单一性，也就是说在模板内部没有错配。

特别是3’端，一定要避免连续4个以上的碱基互补错配。

③引物序列的GC 含量最好在40％一60％，且上下游引物序列GC含量的差异不要太大，3’端最后5个碱基最好不要富含GC，特别是连续3个的G或C。

④DNA双链形成所需的自由能AG，应该以5’端向3’端递减，3’端AG最好不要高于9．0 keaf mol[31。

⑤避免形成稳定的引物二聚体(Dimer and Cross DimeO 和发夹结构(Hairpin)，AG高于
4．5 keal／mol时易引发上述两种结构的产生。

⑥引物所在的模板区域应该位于外显子区，最好跨越一个内含子区，这样便于对扩增出来的片段进行功能鉴定和表型分析。

⑦如果以DNA为模板设计引物，产物长度在100—600 bp比较理想。

而以mRNA为模板设计引物时，产物长度在150—300 bp比较理想。

⑧5’ 端对PCR影响不太大，可以引进修饰位点和标记物[2]。

只要掌握了以上原则和注意事项，我们可以在软件和程序设计的一组引物中筛选出几对我们需要的目标引物。

Primer Premier 5和Oligo 6可以在/soft/下载，primer 3的主页位置在。

2 引物的二次筛选
引物的二次筛选是指在初次筛选出的几对引物中进一步筛选出适合我们进行特异、高效P CR扩增的那对引物。

本步应注意以下两点，一是得到的一系列引物分别在Genebank中进行回检。

也就是把每条引物在比对工具(/blast/) 的blastnr中进行同源性检索，弃掉与基因组其它部分同源性比较高的引物，也就是有可能形成错配的引物。

一般连续10 bp以上的同源有可能形成比较稳定的错配，特别是引物的3’端应避免连续5-6 bp的同源。

二是以mRNA为模板设计引物时要先利用生物信息学的知识大致判断外显子与内含子的剪接位点(例如/GENESCAN.html的GENESCAN 工具或者GeneParser软，然后弃掉正好位于剪接位点的引物。

3 引物的最终评估
当我们经过初次筛选和二次筛选后得到的那对引物便可以用于合成，合成后我们经过PCR 扩增可以对引物进行最终的评估。

一是PCR扩增的特异性和效率。

经过PCR条件优化后能否获得特异性条带，即无目的条带之外的多余条带。

另外，PCR产物的量是否足够，即无不出带和条带很弱的现象。

二是以DNA为模板设计引物时，PCR扩增产物是否与预期P CR产物大小相当。

如果相差太大G 于100 b ，有可能是错配产物。

三是是否形成引物二
聚体带。

我们结合引物最终评估和测序的结果可以对引物设计的成败做出鉴定，为我们以后进行引物设计积累宝贵经验。

4 用比较基因组学分离新基因时引物设计的注意事项
扩增已知基因时经过初次筛选和二次筛选后得到的引物基本上能够满足要求，但是当运用比较基因组学分离新基因时，设计引物还应注意以下两点：①模板的选择。

如果以DNA为模板设计引物，首先在Genebank中找到与待
分离新基因同源的其它物种的该基因。

利用/blast/的Blast工具和/elustalw/的Clustalw工具把已检索到的基因进行同源性比较，根据比
较基因组定位的原理，选择研究深入、标记稠密的人和哺乳动物(如小鼠)保守功能基因DN A序列设计引物[51，该引物区段要求在各物种间绝对保守，差异不要大于2 bp，特别是3’端必须完全同源。

如果以电脑克隆策略获得的待分离物种新基因的EST一重叠群为模板设计引物，要求ESTs与信息探针之间同源性大于80％，长度大于100 bp，并且避免在ES T的并接部位和可能的外显子与内含子剪接位点处设计引物。

②引物序列最好位于相临的外显子区且至少距离外显子与内含子剪接处25 bD以上，这样便于对扩增出来的片段进行功能鉴定和表型分析。

[参考文献]
[1]H．A．艾得希主编，田丁等译．PCR技术一DNA扩增的原理与应用【c】．北京：北京医科大学中国协和医科大学联合出版社，1991．
[2]林万明主编．PCR技术操作和应用指南【c】．北京：人民军医出版社，1993．
[3]Oligo软件帮助文件．
[4]Rychlik，W．and Rhoads，R．E．A computer program for choosing optimal oligo nucleotides for filter hybridization，sequencing and in vitro amplifi—cation of DNA
[J]．Nucleic Acids Res，1989，17：8543-8551．
[5]余梅．猪12号染色体上四个新基因的分离、鉴定与物理定位．华中农业大学，2002 引物设计专栏：
/special/experiment/PrimerDesign.htm
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