影响丙酮丁醇发酵的主要因素及解决方案的研究进展
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第 45 卷第 2 期 2011 年 3 月
生 物 质 化 学 工 程 Biomass Chemical Engineering
Vol． 45 No． 2 Mar． 2011
·综述评论— — —生物质能源·
影响 丙酮丁醇发酵 的 主 要 因 素及 解决 方 案 的研究 进展
高 凯，李 云，杨秀山
*
( 首都师范大学 生命科学学院，北京 100048 ) 摘 要: 制约丙酮丁醇发酵工业化生产的主要问题是丙酮丁 醇 梭菌 在 发 酵 过 程中 孢 子的 形 成、 溶 剂 产 量 低、 副产物的生
1
孢子的形成、 溶剂的生成及菌株的降解
产溶剂梭菌在生长过程中会形成孢子， 虽然枯草芽孢杆菌( Bacillus subtilis ) 孢 子 形 成 的分 子机 制 已 得到了详细的阐述， 但与梭菌孢子形成有关的研究 则 相对 滞 后。研究 表 明 梭 菌 的 孢 子 形 成 机 制与 枯 草 ［5 ］ 芽孢杆菌孢子形成机制类似 。 枯草芽孢杆菌的孢子形成过程需要超过 125 个基因的参与 才 能 完 成， 这 些 基 因 的 转 录 由 6 个 RNA sigH、 sigF、 sigE 、 sigG 和 sigK ) 及 4 个 DNA 结 合 蛋 白 调控 ( Spo0A、 AbrB 、 Hpr 和 聚合酶 sigma 因子( sigA、 ［5 ］ Sin) 。细胞按照一定顺序表达 sigma 因子达到控制细胞 形 态 的 目 的。 枯 草 芽 孢 杆菌 使 用 一套 磷酸 化 系统起始孢子形成( 包括 5 个组氨酸激酶( KinA ～ KinE ) ) 。在这些激酶分别磷酸化 Spo0F 和 Spo0B 后， ［6 ］ 磷酸基团被传递给主调节子 Spo0A。然而尚未在产溶剂梭菌体内发现相似的磷酸化元件 。 磷酸 化的 Spo0A 可以激活静止期基因( 产溶剂 阶 段 ) 或 者 抑 制 早 期 基 因 ( 产 酸 阶 段 ) 的 表 达。 Spo0A 激 活 或 抑 制 基因的转录是通过结合基因启动子上的特殊片段来完成的。与 Spo0A 结合的特异位点是一个具有 7 个 ［7 ］ 碱基的片段( 5'－ TGNCGAA－3' ) ， 称作 0A 盒。Harris 等 抑制 C． acetobutylicum 体内 Spo0A 基因 的 表 达 得到了重组菌株 SKO1 ， 该重组菌株的丙酮和丁醇产量分别降低 至 野 生 型 水平 的 2 % 和 8 % ， 且重组细 胞无法形成成熟的孢子。过表达 Spo0A 基因则加速了菌 株 的 孢 子 形 成 过 程， 并 诱 导 溶剂 合成 关 键 基 因 。 Spo0A 及孢子形成基因提前表达 这些结果均证实了 在调节孢子形成及溶剂生成方面的作用。 SpoIIE 和 SpoIIG 操 纵 子。 SpoIIE 是一 种 磷酸 酶， 被 Spo0A 激活的基因中包括 SpoIIA， 能通过去磷 从 而 释 放 SigF 使 其 转 录 前 芽 孢 特 酸化激活 SpoIIAA。激活后的 SpoIIAA 与 SpoIIAB－SigF 复 合 体 作用， ［8 ］ 异基因。Scotcher 等 通 过下 调 SpoIIE 蛋 白的 表 达 推 迟 了 孢 子 形 成 的 时间， 且没 有 降 低 菌 株 的 溶剂 产 ［9 ］ 量。Jones 等 利用 DNA 微阵列技术揭示了 C． acetobutylicum 孢子形成过程的基因转录水平， 并发现了 CAC1766 和 CAP0167 。使用反义 RNA 技术 分 别 下 调 二 者 的 表 两个新的与孢子形成有关的 sigma 因子， 达使菌株的形态发生了极大变化， 孢 子 的形 成 受 到 了 阻碍， 同 时 菌 株 的 新 陈 代 谢 及 溶剂 生 成 得到 了 提 高。 解除孢子形成和溶剂生产之间联系的另外 一 种 途 径 是 以 C． acetobutylicum 的 突 变菌 株 M5 和 DG1 作为出发菌株( 二者均不产生孢 子 和 溶剂 ) ， 向 细 胞 体 内 重新 导入 并 表 达 溶剂 合成 基 因。 突 变菌 株 M5 ［10 ］ 由于缺失兆质粒 pSOL1 ( 含有 aad 和丙酮合成基因) 而不能生 成 溶剂 ( 丙酮、 丁醇 和 乙 醇 ) 。 Sillers 等 在 M5 菌株体内表达具有 ptb 启动子的 aad 基因， 使突变菌株 M5 恢复了合成丁醇的能力， 其丁醇产量与 。 ， ， ， 野生型相当 此外 由于缺失丙酮合成基因 导致菌株不合成丙酮 从而增加了丁醇的选择性， 有利于降 低回收产物的成本。 丙酮丁醇梭菌在经过连续传代培养 后， 细 胞 降 解， 失 去 产生 孢 子 和 溶剂 的能力。 在 C． acetobutyli［11 ］ cum 属中， 降解是兆质粒 pSOL1 缺失的缘 故， 且 该 兆 质 粒 上 携 带 了 与 溶剂 合成 有 关 的 关 键 基 因 。 孢 子的形成与细胞的降解不利于连续发酵和补料批式发酵工艺， 因此， 在不影响溶剂生成的条件下解除梭 菌形成孢子的能力将有利于提高细胞的生产力， 简化生物加工过程， 进一步降低成本。
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生
物
百度文库
质
化
学
工
程
第 45 卷
［3 ］ 六碳糖和五碳糖则是木质纤维素预处理及水解后的产物 ， 因 此 该 菌 能 更 高 效 的 以 木 质 纤维素 水 解 液 中的五碳糖及六碳糖为底物进行发酵。目前用于研究及工业生产的生物丁醇梭菌主要有丙酮丁醇梭菌 ( Clostridium． acetobutylicum) 和拜氏梭菌( C． beijerinkii) 两个属， 它 们 具有 相 似 的 代 谢 路 径。 C． acetobutylicum 的产物主要分为 3 类: 1 ) 溶剂( 丙酮、 乙醇 和 丁醇) ; 2 ) 有 机 酸 ( 乙 酸、 乳 酸 和 丁酸 ) ; 3 ) 气体 ( 包
The State Art of View of Influenciable Main Factors in Acetone-Butanol Fermentation and Proposed Solutions
GAO Kai，LI Yun，YANG Xiushan
( College of Life Sciences， Capital Normal University， 100048 ，Beijing) Abstract : Major problems，which influenced on the revival of acetonebutanol fermentation ( ABF) ， were analysized． And sporulation of solventogenic clostridia，low butanol yield，production of byproduct，and high substrate cost as well as the toxity of butanol etc． were considered． Reducing substrate cost by employing lignocelluloses as carbon resource has attracted extensive attention and efforts． In this review，these problems mentioned above were discussed． The molecular mechanism leading to the initiation of sporulation and solventogenesis is also investigated． Different strategies are employed in the metabolic engineering of clostridia that aim to enhancing solvent production，improve selectivity for butanol production，and increase the tolerance of clostridia to solvents． Here，the strategies to further improve strain performance and reduce the cost of biobutanol were proposed． Key words: acetonebutanol fermentation; Metabolic engineering; Gas stripping; lignocellulose
在生物燃料领域， 丁醇所具有的优良化学特性使 生物 丁醇成 为 重要 的 新 兴 生物 燃 料 之 一。 由 于 比 乙醇多两个亚甲基， 丁醇具有更高的疏水性， 较低的挥发性， 可与汽油以任意比例混合， 并具有与汽油相
［1 ］ butanol fermen当的热值 。因此， 近年来生物丁醇得到了越来 越 广 泛 的 关 注。 丙酮丁醇发酵 ( aceloneABF) 的主要产物是丙酮、 ABE 一 直 tation， 丁醇和乙醇， 产物比例为 3 ∶ 6 ∶ 1 。 直 到 20 世纪 50 年 代 中 叶， 作为生产丙酮丁醇的主要途径， 后来由于石化工业的发展， 发酵法生产丙酮丁醇的底物成本高及产物回
使用木质纤维素等廉价、 环保的原料作为发酵底物生产生物丁醇 也 是 目前 研究 成以 及 丁 醇 对 菌 株 的 毒 性 等 因 素 。此 外 ， 的热点之一。本文就以上问题综述了近年来的研究进展， 如孢 子 形 成 的分子 机 制 及 解 除 孢 子 形 成 与 溶 剂 生成 之 间 联 系 的途 径 ， 丁醇抑制梭菌细胞生长的机制及降低丁醇毒性的方法， 通过基因工程改造减少副产物的生成， 增 加 丁 醇 产 量 等， 并讨论了进一步改造菌种及降低生物丁醇成本的策略。 关键词: 丙酮丁醇发酵; 基因工程; 气提法; 木质纤维素 中图分类号: TQ351 ; Q815 文献标识码: A 文章编号: 1673 － 5854 ( 2011 ) 02 － 0045 － 06
收耗能大， 逐渐被淘汰。用于 进 行 丙酮丁醇发酵 的微生物 一 般 称为 丙酮丁醇 梭 菌， 或 产 溶剂 梭 菌 ( 丙 酮、 乙醇和丁醇) 。该菌是严格厌氧的 革 兰氏 阳 性 细 菌， 在发酵 过 程 中 形 成 孢 子， 能将糖类物质等转化
［2 ］ 为溶剂。但该菌能利用广泛的底物， 包括单糖( 五碳糖和六碳糖 ) 、 寡 糖、 聚 糖， 以及淀粉类物质等 ， 而
括二氧化碳、 氢气等) 。将产物 中 的氢 气 回 收 可以 进 一 步提 高 ABE 的 经 济 竞争 力。 然 而， 副 产物 如 丙 酮、 乙醇等的生成消耗了有限的碳代谢流， 降低了产物中丁醇所占的比例， 增加了回收丁醇的难度。C． ［4 ］ acetobutylicum 是最常用的生物丁醇生产菌种， 尽管其丁醇代谢路径已经得到了清晰的阐述 ， 然而细胞 控制代谢流的机制尚不清楚， 因此有必要对 C． acetobutylicum 的代谢路径进行全面的分析。
收稿日期: 2011 － 01 － 27 基金项目: 国家 863 计划资助( 2007AA100702 － 2 ; 2007AA05Z405 ; 2010AA101606 ) mail: WTBZgaokai1987629@ 126． com 作者简介: 高 凯( 1987 － ) ， 男， 硕士研究生， 研究方向: 酶与发酵工程。E* 通讯作者: 杨秀山( 1946 － ) ， mail: 教授， 博士生导师， 主要从事微生物 学、 酶 和 发酵 工 程、 微生物与 清 洁 能源的研究和 技术 开 发; Ecnu_xsyang@ 263． net。
生 物 质 化 学 工 程 Biomass Chemical Engineering
Vol． 45 No． 2 Mar． 2011
·综述评论— — —生物质能源·
影响 丙酮丁醇发酵 的 主 要 因 素及 解决 方 案 的研究 进展
高 凯，李 云，杨秀山
*
( 首都师范大学 生命科学学院，北京 100048 ) 摘 要: 制约丙酮丁醇发酵工业化生产的主要问题是丙酮丁 醇 梭菌 在 发 酵 过 程中 孢 子的 形 成、 溶 剂 产 量 低、 副产物的生
1
孢子的形成、 溶剂的生成及菌株的降解
产溶剂梭菌在生长过程中会形成孢子， 虽然枯草芽孢杆菌( Bacillus subtilis ) 孢 子 形 成 的分 子机 制 已 得到了详细的阐述， 但与梭菌孢子形成有关的研究 则 相对 滞 后。研究 表 明 梭 菌 的 孢 子 形 成 机 制与 枯 草 ［5 ］ 芽孢杆菌孢子形成机制类似 。 枯草芽孢杆菌的孢子形成过程需要超过 125 个基因的参与 才 能 完 成， 这 些 基 因 的 转 录 由 6 个 RNA sigH、 sigF、 sigE 、 sigG 和 sigK ) 及 4 个 DNA 结 合 蛋 白 调控 ( Spo0A、 AbrB 、 Hpr 和 聚合酶 sigma 因子( sigA、 ［5 ］ Sin) 。细胞按照一定顺序表达 sigma 因子达到控制细胞 形 态 的 目 的。 枯 草 芽 孢 杆菌 使 用 一套 磷酸 化 系统起始孢子形成( 包括 5 个组氨酸激酶( KinA ～ KinE ) ) 。在这些激酶分别磷酸化 Spo0F 和 Spo0B 后， ［6 ］ 磷酸基团被传递给主调节子 Spo0A。然而尚未在产溶剂梭菌体内发现相似的磷酸化元件 。 磷酸 化的 Spo0A 可以激活静止期基因( 产溶剂 阶 段 ) 或 者 抑 制 早 期 基 因 ( 产 酸 阶 段 ) 的 表 达。 Spo0A 激 活 或 抑 制 基因的转录是通过结合基因启动子上的特殊片段来完成的。与 Spo0A 结合的特异位点是一个具有 7 个 ［7 ］ 碱基的片段( 5'－ TGNCGAA－3' ) ， 称作 0A 盒。Harris 等 抑制 C． acetobutylicum 体内 Spo0A 基因 的 表 达 得到了重组菌株 SKO1 ， 该重组菌株的丙酮和丁醇产量分别降低 至 野 生 型 水平 的 2 % 和 8 % ， 且重组细 胞无法形成成熟的孢子。过表达 Spo0A 基因则加速了菌 株 的 孢 子 形 成 过 程， 并 诱 导 溶剂 合成 关 键 基 因 。 Spo0A 及孢子形成基因提前表达 这些结果均证实了 在调节孢子形成及溶剂生成方面的作用。 SpoIIE 和 SpoIIG 操 纵 子。 SpoIIE 是一 种 磷酸 酶， 被 Spo0A 激活的基因中包括 SpoIIA， 能通过去磷 从 而 释 放 SigF 使 其 转 录 前 芽 孢 特 酸化激活 SpoIIAA。激活后的 SpoIIAA 与 SpoIIAB－SigF 复 合 体 作用， ［8 ］ 异基因。Scotcher 等 通 过下 调 SpoIIE 蛋 白的 表 达 推 迟 了 孢 子 形 成 的 时间， 且没 有 降 低 菌 株 的 溶剂 产 ［9 ］ 量。Jones 等 利用 DNA 微阵列技术揭示了 C． acetobutylicum 孢子形成过程的基因转录水平， 并发现了 CAC1766 和 CAP0167 。使用反义 RNA 技术 分 别 下 调 二 者 的 表 两个新的与孢子形成有关的 sigma 因子， 达使菌株的形态发生了极大变化， 孢 子 的形 成 受 到 了 阻碍， 同 时 菌 株 的 新 陈 代 谢 及 溶剂 生 成 得到 了 提 高。 解除孢子形成和溶剂生产之间联系的另外 一 种 途 径 是 以 C． acetobutylicum 的 突 变菌 株 M5 和 DG1 作为出发菌株( 二者均不产生孢 子 和 溶剂 ) ， 向 细 胞 体 内 重新 导入 并 表 达 溶剂 合成 基 因。 突 变菌 株 M5 ［10 ］ 由于缺失兆质粒 pSOL1 ( 含有 aad 和丙酮合成基因) 而不能生 成 溶剂 ( 丙酮、 丁醇 和 乙 醇 ) 。 Sillers 等 在 M5 菌株体内表达具有 ptb 启动子的 aad 基因， 使突变菌株 M5 恢复了合成丁醇的能力， 其丁醇产量与 。 ， ， ， 野生型相当 此外 由于缺失丙酮合成基因 导致菌株不合成丙酮 从而增加了丁醇的选择性， 有利于降 低回收产物的成本。 丙酮丁醇梭菌在经过连续传代培养 后， 细 胞 降 解， 失 去 产生 孢 子 和 溶剂 的能力。 在 C． acetobutyli［11 ］ cum 属中， 降解是兆质粒 pSOL1 缺失的缘 故， 且 该 兆 质 粒 上 携 带 了 与 溶剂 合成 有 关 的 关 键 基 因 。 孢 子的形成与细胞的降解不利于连续发酵和补料批式发酵工艺， 因此， 在不影响溶剂生成的条件下解除梭 菌形成孢子的能力将有利于提高细胞的生产力， 简化生物加工过程， 进一步降低成本。
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百度文库
质
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工
程
第 45 卷
［3 ］ 六碳糖和五碳糖则是木质纤维素预处理及水解后的产物 ， 因 此 该 菌 能 更 高 效 的 以 木 质 纤维素 水 解 液 中的五碳糖及六碳糖为底物进行发酵。目前用于研究及工业生产的生物丁醇梭菌主要有丙酮丁醇梭菌 ( Clostridium． acetobutylicum) 和拜氏梭菌( C． beijerinkii) 两个属， 它 们 具有 相 似 的 代 谢 路 径。 C． acetobutylicum 的产物主要分为 3 类: 1 ) 溶剂( 丙酮、 乙醇 和 丁醇) ; 2 ) 有 机 酸 ( 乙 酸、 乳 酸 和 丁酸 ) ; 3 ) 气体 ( 包
The State Art of View of Influenciable Main Factors in Acetone-Butanol Fermentation and Proposed Solutions
GAO Kai，LI Yun，YANG Xiushan
( College of Life Sciences， Capital Normal University， 100048 ，Beijing) Abstract : Major problems，which influenced on the revival of acetonebutanol fermentation ( ABF) ， were analysized． And sporulation of solventogenic clostridia，low butanol yield，production of byproduct，and high substrate cost as well as the toxity of butanol etc． were considered． Reducing substrate cost by employing lignocelluloses as carbon resource has attracted extensive attention and efforts． In this review，these problems mentioned above were discussed． The molecular mechanism leading to the initiation of sporulation and solventogenesis is also investigated． Different strategies are employed in the metabolic engineering of clostridia that aim to enhancing solvent production，improve selectivity for butanol production，and increase the tolerance of clostridia to solvents． Here，the strategies to further improve strain performance and reduce the cost of biobutanol were proposed． Key words: acetonebutanol fermentation; Metabolic engineering; Gas stripping; lignocellulose
在生物燃料领域， 丁醇所具有的优良化学特性使 生物 丁醇成 为 重要 的 新 兴 生物 燃 料 之 一。 由 于 比 乙醇多两个亚甲基， 丁醇具有更高的疏水性， 较低的挥发性， 可与汽油以任意比例混合， 并具有与汽油相
［1 ］ butanol fermen当的热值 。因此， 近年来生物丁醇得到了越来 越 广 泛 的 关 注。 丙酮丁醇发酵 ( aceloneABF) 的主要产物是丙酮、 ABE 一 直 tation， 丁醇和乙醇， 产物比例为 3 ∶ 6 ∶ 1 。 直 到 20 世纪 50 年 代 中 叶， 作为生产丙酮丁醇的主要途径， 后来由于石化工业的发展， 发酵法生产丙酮丁醇的底物成本高及产物回
使用木质纤维素等廉价、 环保的原料作为发酵底物生产生物丁醇 也 是 目前 研究 成以 及 丁 醇 对 菌 株 的 毒 性 等 因 素 。此 外 ， 的热点之一。本文就以上问题综述了近年来的研究进展， 如孢 子 形 成 的分子 机 制 及 解 除 孢 子 形 成 与 溶 剂 生成 之 间 联 系 的途 径 ， 丁醇抑制梭菌细胞生长的机制及降低丁醇毒性的方法， 通过基因工程改造减少副产物的生成， 增 加 丁 醇 产 量 等， 并讨论了进一步改造菌种及降低生物丁醇成本的策略。 关键词: 丙酮丁醇发酵; 基因工程; 气提法; 木质纤维素 中图分类号: TQ351 ; Q815 文献标识码: A 文章编号: 1673 － 5854 ( 2011 ) 02 － 0045 － 06
收耗能大， 逐渐被淘汰。用于 进 行 丙酮丁醇发酵 的微生物 一 般 称为 丙酮丁醇 梭 菌， 或 产 溶剂 梭 菌 ( 丙 酮、 乙醇和丁醇) 。该菌是严格厌氧的 革 兰氏 阳 性 细 菌， 在发酵 过 程 中 形 成 孢 子， 能将糖类物质等转化
［2 ］ 为溶剂。但该菌能利用广泛的底物， 包括单糖( 五碳糖和六碳糖 ) 、 寡 糖、 聚 糖， 以及淀粉类物质等 ， 而
括二氧化碳、 氢气等) 。将产物 中 的氢 气 回 收 可以 进 一 步提 高 ABE 的 经 济 竞争 力。 然 而， 副 产物 如 丙 酮、 乙醇等的生成消耗了有限的碳代谢流， 降低了产物中丁醇所占的比例， 增加了回收丁醇的难度。C． ［4 ］ acetobutylicum 是最常用的生物丁醇生产菌种， 尽管其丁醇代谢路径已经得到了清晰的阐述 ， 然而细胞 控制代谢流的机制尚不清楚， 因此有必要对 C． acetobutylicum 的代谢路径进行全面的分析。
收稿日期: 2011 － 01 － 27 基金项目: 国家 863 计划资助( 2007AA100702 － 2 ; 2007AA05Z405 ; 2010AA101606 ) mail: WTBZgaokai1987629@ 126． com 作者简介: 高 凯( 1987 － ) ， 男， 硕士研究生， 研究方向: 酶与发酵工程。E* 通讯作者: 杨秀山( 1946 － ) ， mail: 教授， 博士生导师， 主要从事微生物 学、 酶 和 发酵 工 程、 微生物与 清 洁 能源的研究和 技术 开 发; Ecnu_xsyang@ 263． net。