高效大豆根瘤菌的筛选

高效大豆根瘤菌的筛选
作者：张欣，李玉文转贴自：本站原创
(1．东北林业大学林学院；2．黑龙江省科学院生物肥料研究中心，黑龙江哈尔滨150086)
摘要：将选取的10株大豆根瘤菌菌株(HLJN1001，HLJN1002，HLJN1003，HLJN1004，HLJN10 05，HLJN1006，HLJN1007，HLJN1008，HLJN1009，HLJN10010)与在黑龙江省大面积栽培的5 个大豆品种（垦农18号，垦鉴豆25号，合丰25号，疆丰21-1381号，绥农4号）进行最佳共生匹配双瓶筛选试验，测定了大豆植株株高、叶片颜色、结瘤数、瘤干重和植株地上部分干重等生物学指标并进行统计分析，从中筛选出共生固氮结瘤能力强的优良菌株HLJN1001和HLJN 1003。

关键词：大豆根瘤菌；大豆品种；共生匹配；筛选
中图分类号：S565.1 文献标识码：A 文章编号：1007—6921(2011)10—0125—03
根瘤菌(Rhizobium)是一类广泛分布于土壤中的革兰氏阴性细菌，它可以侵染豆科植物根部，形成根瘤，固定空气中的分子态氮形成氨，为植物提供氮素营养。

但根瘤菌与豆科植物独立存在时，不能利用大气中的N2，而当根瘤菌侵入豆科植物的根细胞并在其中迅速增殖后，可产生类菌体，并在根瘤内出现豆血红蛋白，同时具备类菌体和豆血红蛋白的根瘤便具有固氮能力。

研究表明，不同的根瘤菌与大豆品种间的共生固氮能力存在着较大的差异［1,2］ 。

因此，筛选与豆科作物品种匹配、固氮能力好、竞争结瘤能力强的优良菌株，是提高根瘤菌应用效果的重要途径［3］。

现选取10株大豆根瘤菌菌株，与5个在黑龙江省大面积栽培的大豆品种进行共生匹配性研究，从中筛选出优良菌株，为大豆育种材料的选择和共生固氮作用的发挥提供依据。

1 材料与方法
1.1 试验材料
1.1.1 供试菌株
HLJN1001，HLJN1002，HLJN1003，HLJN1004，HLJN1005，HLJN1006，HLJN1007，HLJN1008，HLJN1009，
HLJN10010，共10株，由黑龙江省科学院生物肥料研究中心提供。

1.1.2 供试大豆品种
垦农18号，垦鉴豆25号，合丰25号，疆丰21-1381号，绥农4号，共5个，为在黑龙江省广泛栽培的具有代表性的大豆品种。

1.1.3 培养基
YMA：甘露醇10.0g，K 2HPO4 0.25g， KH2PO4 0.25g，MgSO4 0.20g，NaCl 0. 10g ，CaCO3 3.00g，琼脂粉15g，蒸馏水1 000ml，pH调至6.8～7.0；Fahraeus无氮植物营养液（mg/l）：Na2HPO4 150，KH2PO 4 100，MgSO4·7H2SO4 120，CaCl2 10 0，Fecitrate 5，pH 6.5；Gibson微量元素液（g/l）：H 3BO 3 2.86，MnSO4·H2O 2.08，ZnSO4·7H2O 0.22 ，CuSO4·5H2O 0.08，Na2MoO4 0.11，加无菌水至1 000ml，使用时接1.0mg/l加入无氮培养基中。

1.2 试验方法
1.2.1 大豆根瘤菌的培养
将大豆根瘤菌HLJN1001，HLJN1002，HLJN1003，HLJN1004，HLJN1005，HLJN1006，HLJN 1007，HLJN1008，HLJN1009，HLJN10010分别进行活化后，接种于大豆根瘤菌YMA液体培养基中，用摇瓶培养法在30℃培养条件下200rpm摇床中培养至发酵液菌体密度50亿个/ml以上后，置于4℃的冰箱中低温保存备用。

1.2.2 有效活菌数测定方法
血球板计数法结合平板稀释活菌计数法计算大豆根瘤菌数量；革兰氏染色、常规染色进行大豆根瘤菌生长状况检测及定性分析。

1.2.3 双瓶栽培法筛选大豆根瘤菌菌种
此方法温室最佳共生匹配试验方案。

1.2.3.1 选取优良的大豆种子，放入无菌培养皿中，加入95%的乙醇，用枪头反复冲洗，以使种子表面被完全浸润。

5min后吸掉乙醇，加入0.1%的升汞5ml，反复抽洗，消毒5min ，然后用无菌生理盐水反复冲洗3次。

1.2.3.2 将表面消毒的种子置于垫有湿润滤纸的无菌培养皿中，于28℃温箱中培养2d～3d ，待主根长到
2cm～3cm时，进行栽培和接种。

1.2.3.3 采用双瓶法进行结瘤试验，每个大豆品种种植4瓶，每瓶中种植2株，共种植8株大豆植株。

将萌发的无菌大豆种子种于无菌双层瓶中，上层的塑料瓶中装满灭过菌的蛭石，下层玻璃瓶中装有无氮营养液，用纱布经上层的塑料瓶底部的小孔引流到上层瓶中，以保持上层瓶中蛭石的湿润度，双层瓶及其中的培养基和营养液都经过121℃高温湿热灭菌1h后冷却至室温备用。

1.2.3.4 选取上述在YMA培养基中培养至对数期的大豆根瘤菌菌液，以5 000RPM离心5min收集菌体，用生理盐水重悬菌液，调整其浓度为107个/ml～108个/ml。

每瓶栽培大豆中大豆根瘤菌的接种量为1ml，以不接种的大豆为对照，每组处理设4瓶重复，将双层瓶随机摆放在温室中，每天光照时间为12h，光照强度为5 000Lux.，温度为20℃～28℃，培养至50d时收获。

1.2.3.5 在生长过程中和收获后检测植物的生长状况，主要检测以下一些生物学指标：①株高：测量试验的植株的株高，从子叶痕至植株顶端的高度，以厘米为单位表示；②叶片颜色：选取有代表性植株的完全展开的叶片检定大豆叶片的叶色状况，叶色状况分为很黄，微黄，微绿，浅绿，很绿五个级别；③主根和侧根上的结瘤数量：将根连带培养基质小心拔出，用清水小心地将附土冲洗干净，计数主根和侧根上的根瘤数；④所结根瘤的干重：将所结的根瘤小心地剪下，在烘箱中70℃条件下烘干至恒重后测量瘤的干重；
⑤植株地上部分干重：用1/10天平称取10株植株地上部分的鲜重，用烘箱于70℃条件下烘干至恒重后测出植株的干重。

1.3 数据分析
利用邓肯氏新复极差法（DPS）和Excel软件分析处理数据。

2 结果与分析
试验设空白对照组（ck），即不接种大豆根瘤菌，结果见表1,表2,表3,表4,表5：
注：①Y:叶黄色；YG:叶黄绿色；G:叶绿色；VG:叶深绿色；②以上数据是10个植株的平均数；③同列不同字母表示相互间差异显著（P>0.05）。

由表1可以看出，接种大豆根瘤菌HLJN1001、HLJN1003和HLJN1006的大豆植株株高、叶片颜色、结瘤数、瘤干重和植株地上部分干重等生物学指
注：①Y:叶黄色；YG:叶黄绿色；G:叶绿色；VG:叶深绿色；②以上数据是10个植株的平均数；③同列不同字母表示相互间差异显著（P>0.05）。

标明显优于接种其他几个菌株的大豆植株相应的生物学指标。

由表2可以看出，接种大豆根瘤菌HLJN1001、HLJN1003和HLJN1005的大豆植株株高、叶片颜色、结瘤数、瘤干重和植株地上部分干重等生物学指标明显优于接种其他几个菌株的大豆植株相应的生物学指标。

注：①Y:叶黄色；YG:叶黄绿色；G:叶绿色；VG:叶深绿色；②以上数据是10个植株的平均数；③同列不同字母表示相互间差异显著（P>0.05）。

由表3可以看出，接种大豆根瘤菌HLJN1001、HLJN1003和HLJN1008的大豆植株株高、叶片颜色、结瘤数、瘤干重和植株地上部分干重等生物学指标明显优于接种其他几个菌株的大豆植株相应的生物学指标。

注：①Y:叶黄色；YG:叶黄绿色；G:叶绿色；VG:叶深绿色；②以上数据是10个植株的平均数；③同列不同字母表示相互间差异显著（P>0.05）。

由表4可以看出，接种大豆根瘤菌HLJN1001、HLJN1003和HLJN1009的大豆植株株高、叶片颜色、结瘤数、瘤干重和植株地上部分干重等生物学指标明显优于接种其他几个菌株的大豆植株相应的生物学指标。

注：①Y:叶黄色；YG:叶黄绿色；G:叶绿色；VG:叶深绿色；②以上数据是10个植株的平均数；③同列不同字母表示相互间差异显著（P>0.05）。

由表5可以看出，接种大豆根瘤菌HLJN1001和HLJN1003 的大豆植株株高、叶片颜色、结瘤数、瘤干重和植株地上部分干重等生物学指标明显优于接种其他几个菌株的大豆植株相应的生物学指标。

3 结论
接种高效大豆根瘤菌能够增加大豆根瘤数量和根部的固氮量，增加大豆生长各个时期的氮素供给量，增加大豆植株干物质的积累，最终达到使大豆增产的目的。

从以上各组试验结果可以看出，我们所选择的用于本试验的大豆根瘤菌菌株，都能够与黑龙江省广泛栽培的具有代表性的大豆品种进行共生匹配、结瘤固氮，但固氮结瘤的能力和对植物生长的促进作用，却存在着较大的差异。

通过比较上述5组共生匹配试验结果，证明在供试的10个大豆根瘤菌菌株中，HLJN1001和HLJN1003这两株大豆根瘤菌，在与黑龙江省广泛栽培的具有代表性的5个大豆品种进行的最佳共生匹配试验中，均表现出了良好的生物共生固氮结瘤效果，接种它们的大豆植株在株高、叶片颜色、结瘤数、瘤干重和植株地上部分干重等指标上，均明显地优于接种其他根瘤菌菌株的植株，其他的7个菌株对个别的品种具有较好的亲和性，而对其他的栽培大豆品种则亲和性不佳，说明这些大豆根瘤菌与大豆的共生结瘤固氮具有一定的选择局限性。

HLJN1001是我们参加欧盟项目获得的大豆根瘤菌菌株，HLJN1003是我们选育的土著高效根瘤菌，上述的最佳共生匹配试验结果显示：这两个菌株都表现了很好的生物共生结瘤固氮效果，说明经过对外合作和最佳共生匹配筛选都可以获得优良的大豆根瘤菌菌株，为大豆根瘤菌的试验研究和肥料生产提供优良的微生物种质资源。

［参考文献］
［1］郭春景，杨旭升，陈锡时．大豆根瘤菌与黑龙江省主栽大豆品种共生匹配的研究［J］．大豆通报，2004，(2)：6～8.
［2］Kiel's E T．Hutton M G，Denison R F．Human selection and the relaxat ion of legume defences against ineffective rhizobia［J］．Proceedings of The Roy al Society／Biological Sciences，2007，274(1629)：3119～3126.
［3］马中雨，李俊，张永芳，等．大豆根瘤菌与大豆品种共生匹配性研究［J］．大豆科学，2008，27(2)：221～227.。