高效大豆根瘤菌的筛选

高效大豆根瘤菌的筛选

作者：张欣，李玉文转贴自：本站原创

(1．东北林业大学林学院；2．黑龙江省科学院生物肥料研究中心，黑龙江哈尔滨150086)

摘要：将选取的10株大豆根瘤菌菌株(HLJN1001，HLJN1002，HLJN1003，HLJN1004，HLJN10 05，HLJN1006，HLJN1007，HLJN1008，HLJN1009，HLJN10010)与在黑龙江省大面积栽培的5 个大豆品种（垦农18号，垦鉴豆25号，合丰25号，疆丰21-1381号，绥农4号）进行最佳共生匹配双瓶筛选试验，测定了大豆植株株高、叶片颜色、结瘤数、瘤干重和植株地上部分干重等生物学指标并进行统计分析，从中筛选出共生固氮结瘤能力强的优良菌株HLJN1001和HLJN 1003。

关键词：大豆根瘤菌；大豆品种；共生匹配；筛选

中图分类号：S565.1 文献标识码：A 文章编号：1007—6921(2011)10—0125—03

根瘤菌(Rhizobium)是一类广泛分布于土壤中的革兰氏阴性细菌，它可以侵染豆科植物根部，形成根瘤，固定空气中的分子态氮形成氨，为植物提供氮素营养。但根瘤菌与豆科植物独立存在时，不能利用大气中的N2，而当根瘤菌侵入豆科植物的根细胞并在其中迅速增殖后，可产生类菌体，并在根瘤内出现豆血红蛋白，同时具备类菌体和豆血红蛋白的根瘤便具有固氮能力。研究表明，不同的根瘤菌与大豆品种间的共生固氮能力存在着较大的差异［1,2］ 。因此，筛选与豆科作物品种匹配、固氮能力好、竞争结瘤能力强的优良菌株，是提高根瘤菌应用效果的重要途径［3］。现选取10株大豆根瘤菌菌株，与5个在黑龙江省大面积栽培的大豆品种进行共生匹配性研究，从中筛选出优良菌株，为大豆育种材料的选择和共生固氮作用的发挥提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试菌株

HLJN1001，HLJN1002，HLJN1003，HLJN1004，HLJN1005，HLJN1006，HLJN1007，HLJN1008，HLJN1009，

HLJN10010，共10株，由黑龙江省科学院生物肥料研究中心提供。

1.1.2 供试大豆品种

垦农18号，垦鉴豆25号，合丰25号，疆丰21-1381号，绥农4号，共5个，为在黑龙江省广泛栽培的具有代表性的大豆品种。

1.1.3 培养基

YMA：甘露醇10.0g，K 2HPO4 0.25g， KH2PO4 0.25g，MgSO4 0.20g，NaCl 0. 10g ，CaCO3 3.00g，琼脂粉15g，蒸馏水1 000ml，pH调至6.8～7.0；Fahraeus无氮植物营养液（mg/l）：Na2HPO4 150，KH2PO 4 100，MgSO4·7H2SO4 120，CaCl2 10 0，Fecitrate 5，pH 6.5；Gibson微量元素液（g/l）：H 3BO 3 2.86，MnSO4·H2O 2.08，ZnSO4·7H2O 0.22 ，CuSO4·5H2O 0.08，Na2MoO4 0.11，加无菌水至1 000ml，使用时接1.0mg/l加入无氮培养基中。

1.2 试验方法

1.2.1 大豆根瘤菌的培养

将大豆根瘤菌HLJN1001，HLJN1002，HLJN1003，HLJN1004，HLJN1005，HLJN1006，HLJN 1007，HLJN1008，HLJN1009，HLJN10010分别进行活化后，接种于大豆根瘤菌YMA液体培养基中，用摇瓶培养法在30℃培养条件下200rpm摇床中培养至发酵液菌体密度50亿个/ml以上后，置于4℃的冰箱中低温保存备用。

1.2.2 有效活菌数测定方法

血球板计数法结合平板稀释活菌计数法计算大豆根瘤菌数量；革兰氏染色、常规染色进行大豆根瘤菌生长状况检测及定性分析。

1.2.3 双瓶栽培法筛选大豆根瘤菌菌种

此方法温室最佳共生匹配试验方案。

1.2.3.1 选取优良的大豆种子，放入无菌培养皿中，加入95%的乙醇，用枪头反复冲洗，以使种子表面被完全浸润。5min后吸掉乙醇，加入0.1%的升汞5ml，反复抽洗，消毒5min ，然后用无菌生理盐水反复冲洗3次。

1.2.3.2 将表面消毒的种子置于垫有湿润滤纸的无菌培养皿中，于28℃温箱中培养2d～3d ，待主根长到

2cm～3cm时，进行栽培和接种。

1.2.3.3 采用双瓶法进行结瘤试验，每个大豆品种种植4瓶，每瓶中种植2株，共种植8株大豆植株。将萌发的无菌大豆种子种于无菌双层瓶中，上层的塑料瓶中装满灭过菌的蛭石，下层玻璃瓶中装有无氮营养液，用纱布经上层的塑料瓶底部的小孔引流到上层瓶中，以保持上层瓶中蛭石的湿润度，双层瓶及其中的培养基和营养液都经过121℃高温湿热灭菌1h后冷却至室温备用。

1.2.3.4 选取上述在YMA培养基中培养至对数期的大豆根瘤菌菌液，以5 000RPM离心5min收集菌体，用生理盐水重悬菌液，调整其浓度为107个/ml～108个/ml。每瓶栽培大豆中大豆根瘤菌的接种量为1ml，以不接种的大豆为对照，每组处理设4瓶重复，将双层瓶随机摆放在温室中，每天光照时间为12h，光照强度为5 000Lux.，温度为20℃～28℃，培养至50d时收获。

1.2.3.5 在生长过程中和收获后检测植物的生长状况，主要检测以下一些生物学指标：①株高：测量试验的植株的株高，从子叶痕至植株顶端的高度，以厘米为单位表示；②叶片颜色：选取有代表性植株的完全展开的叶片检定大豆叶片的叶色状况，叶色状况分为很黄，微黄，微绿，浅绿，很绿五个级别；③主根和侧根上的结瘤数量：将根连带培养基质小心拔出，用清水小心地将附土冲洗干净，计数主根和侧根上的根瘤数；④所结根瘤的干重：将所结的根瘤小心地剪下，在烘箱中70℃条件下烘干至恒重后测量瘤的干重；

⑤植株地上部分干重：用1/10天平称取10株植株地上部分的鲜重，用烘箱于70℃条件下烘干至恒重后测出植株的干重。

1.3 数据分析

利用邓肯氏新复极差法（DPS）和Excel软件分析处理数据。

2 结果与分析

试验设空白对照组（ck），即不接种大豆根瘤菌，结果见表1,表2,表3,表4,表5：

注：①Y:叶黄色；YG:叶黄绿色；G:叶绿色；VG:叶深绿色；②以上数据是10个植株的平均数；③同列不同字母表示相互间差异显著（P>0.05）。

由表1可以看出，接种大豆根瘤菌HLJN1001、HLJN1003和HLJN1006的大豆植株株高、叶片颜色、结瘤数、瘤干重和植株地上部分干重等生物学指