糖基化磷脂酰肌醇特异性磷脂酶D的表达与白血病细胞黏附和侵袭性的关系
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性磷脂酶 Ｄ（ Ｐ —Ｐ Ｄ） Ｇ Ｉ Ｌ 的表 达， 讨 Ｇ Ｉ Ｌ 探 Ｐ —Ｐ Ｄ表达与不同白血病细胞黏附性 、 迁移性的关系。方法 采用黏 附
实验 和 体 外 穿膜 实验 比 较 ３种 不 同 白 血 病 细 胞 的 黏 附 性 和 侵 袭 性 ； 定 量 Ｒ 半 Ｔ—Ｐ Ｒ 检 测 这 些 白 血 病 细 胞 Ｃ Ｇ Ｉ Ｐ Ｄ ｕＡ Ｎ 的表 达 水 平 ； 疫 印 迹 法检 测 细 胞 Ｇ Ｉ Ｌ 的 表 达 ； 式 细胞 术 检 测 细胞 膜 ｕ Ａ 的 Ｐ — Ｌ 和 Ｐ Ｒ ｍＲ Ａ 免 Ｐ —Ｐ Ｄ 流 ＰＲ
・
１４・ ５
广 东医 学
２１ ０ １年 １ 第 ３ 月 ２卷 第 ２期
Ｇ ａ ｇ ｏ ｇＭ ｅｉａ Ｊ ｕ ｎｌ Ｊｎ ０ １ Ｖ １ ２ ｏ ｕ ｎ ｄ ｎ ｄｃｌ ｏ ｒ ａ ａ．２ １ ， ｏ．３ ，Ｎ ．２
糖 基 化磷脂 酰肌 醇特 异性 磷 脂 酶 Ｄ的表 达 与 白血病 细 胞 黏 附和侵 袭性 的关 系
度为 ４ ５ｂ 。取扩增 产物 ５ ５ ｐ ， １５ 琼脂糖胶 在 用 ．％
８ 电 压 下 电 泳 ４ ５Ｖ ５～６ ｉ 。采 用 Ｉ ａ ｅ ｓ ｒＤ Ｓ ０ ｍｎ ｍ ｇ ｍａｔ Ｖ ｅ
中起着重要作用 ， 其表达水平与其恶性表型相关
。
我 们 以前 的研 究 发 现 ， 性 髓 性 白血 病 组 骨 髓 单 个 核 急 细胞 Ｇ Ｉ Ｐ Ｄ 性 和 ｍ Ｎ 的 表 达 均 高 于 正 常 对 照 Ｐ—Ｌ活 Ｒ Ａ
１６ 体 外 穿膜 实验 ． 参考 Ｅ Ｇ Ｒ Ｎ Ｅ Ｓ等 的 方 法 ， 并
显著性 （ ０ ０ ） 见 图 ２ 表 １ Ｐ＞ ．５ ， ， 。
ＧＰ． １ＰＬＤ
ＧＡ Ｐ Ｈ Ｄ
作适 当修改 。采用直径 ６ ５ｍ 孔径 ８ ． ｍ、 ｍ的 ｔ ｎｗ ｌ ｒ ｓｅ ａ ｌ
板 ， 上 铺 ５ｍ ／ ＬＥ Ｍ 胶 ５ Ｌ 用 Ｒ Ｍ ６ ０稀 膜 ｇｍ Ｃ Ｏ （ Ｐ Ｉ１４ 释 ） ３ ℃ ３ ｉ 胶 。调 整 细 胞 浓 度 为 ２×１。ｍ ， ，７ ０ｍ ｎ成 ０／ Ｌ 取 １０ Ｌ细 胞 悬 液 加 入 上 层 ， 层 加 入 无 血 清 Ｒ ＭＩ ０ 下 Ｐ １４ ６ ０培 养 基 ６０ （ Ｆ Ｏ ｇｍ ） 培 养 于 ３ ￣ ０ 含 ｎ １ ／ Ｌ ， ７Ｃ、 ５ Ｃ ， 件 下 ２ 。取 出滤 膜 ，％ 多 聚 甲醛 于 ４ 固 ％ Ｏ条 ４ｈ ４ ℃ 定膜 ３ ｉ，Ｂ 洗 ２次 ， 人 ０ １ ０ｒｎ Ｐ Ｓ ａ 加 ． ％结 晶紫 染 色 ， 棉 用 签 仔 细 擦 掉 位 于 膜 内表 面 的 未 穿 过 膜 的 细 胞 ， 倍 镜 高 下 （× ０ ） 数 膜 背 面 ５个 视 野 的 细 胞 数 ， 算 出每 个 ４０ 计 计
核细 胞 白血 病 细 胞 株 Ｔ Ｐ一１细 胞 均 为 本 科 室 自存 。 Ｈ
细胞培养于含 １ ％ 小牛血清 的 Ｒ Ｍ １４ ０ Ｐ Ｉ６０培 养基 中，
于 ３ ℃ 、％Ｃ 饱 和 湿 度条 件 下 培 养 。 ７ ５ Ｏ、
１ ２ Ｒ —Ｐ Ｒ 检 坝 细 胞 中 Ｇ Ｉ Ｌ ｕ ＡＲ ｍＲＮ ． Ｔ Ｃ ４ Ｐ —Ｐ Ｄ、 Ｐ Ａ
Ｔ Ｐ一１细胞 对 Ｆ Ｈ ｎ的 黏 附率 显 著 高 于 Ｋ ６ 、 Ｌ一 ０细胞 ； Ｈ ５２ Ｈ ６ Ｔ Ｐ一１与 Ｈ ６ 细胞 体 外 穿 膜 侵 袭 能 力 显 著 高 于 Ｌ一 ０ ｌ６ （ ２细胞 。结 论 ５ ｕＡ Ｐ Ｒ表 达 有 关。
【 关键词 】 Ｇ Ｉ Ｐ Ｄ 白血病细胞 ； 附； Ｐ— Ｌ ； 黏 迁移 白血病 是 血 液 系统 的恶 性 克 隆性 疾 病 ， 广 泛 浸 可
１ １ 细胞培养 ．
人慢 性粒细胞性 白血病 急变细胞株
闭 ２ｈ加 入 Ｇ Ｉ Ｌ ， Ｐ —Ｐ Ｄ一抗 室温 孵 育 １ｈ １ ５０稀 （ ：０
释）Ｔ Ｓ ，Ｂ Ｔ漂 洗 ３次 后 用 辣 根 过 氧 化 物 酶 标 记 的二 抗
Ｋ ６ 、 性 粒 细胞 白血 病 细 胞 株 ＨＬ一６ ５２ 急 ０细 胞 ， 性 单 急
关 。 已有 的研 究 表 明 急性 髓 性 白血 病 患 者 中 普 遍
海英骏生物 公 司合成 ， 内参照 ｐ—ａｔ ｃｎ引物 序列 ： ｉ 上
游 ： 一 ，Ｉ Ｃ Ｃ ＧＣ Ｃ Ｔ Ｔ Ｃ 一３ ， 游 ： 一 ５ ＩＴ Ａ Ｇ Ｔ Ｃ Ａ Ｙ Ａ Ｔｒ 下 ５
Ｔｑ Ａ Ｔ Ａ Ｇ Ａ Ｇ Ａ Ｔ Ａ 一３， 增 产 物 长 度 为 ｌ＇ Ｇ Ｙ Ｇ Ｇ Ｔ Ｔ Ｇ Ｃ Ｃ 扩 ２ ３ ｂ 。Ｇ Ｉ Ｌ 引 物 序 列 ： 游 ： 一 Ｃ Ａ － ７ ｐ Ｐ—Ｐ Ｄ 上 ５ Ｃ Ｃ
ＧＡ ＡＣ Ａ Ｃ Ｔ Ａ Ｔ Ｃ 一３ ， 游 ： 一Ｔ Ａ ＡＣ Ｃ Ａ Ｔ Ｃ Ｔ Ｃ ＡＣ Ｃ 下 ５ ＣＴ Ｔ．
过表达 Ｇ Ｉ Ｐ 锚定黏附分子 ｕ Ａ 高表 达 ｕ Ａ Ｐ Ｒ， Ｐ Ｒ的急性 白血病患者常出现肝 、 、 脾 皮肤和黏膜等 白血病 细胞髓 外组织浸 润 。研究 证实 ， 糖基化 磷脂 酰肌 醇特异 性磷脂酶 Ｄ（ Ｐ —Ｐ Ｄ） Ｇ Ｉ Ｌ 在肿瘤 细胞浸 润及转 移过程
室温孵育 ２ｈ Ｔ Ｓ ， Ｂ Ｔ漂洗 ３次后 Ｅ Ｌ法暗室 中曝光 ， Ｃ 显 影 。选用 Ｇ Ｐ Ｈ 上海康成 ） ＡＤ （ 作为内参 ，： ０ １２０ ０稀释。
１４ 流 式 细胞 术 检 测 细 胞 膜 锚 定 蛋 白 ｕＡ 的 表 达 ． ＰＲ 取 ３×１’ ５２ Ｈ ０ Ｋ ６ 、 Ｌ一 ０ Ｔ Ｐ—ｌ细 胞 ， 入 ｌ Ｌ ６ 、Ｈ 加 ０ 小 鼠抗人 的 ｕ Ａ Ｐ Ｒ单 抗 （ ． ｍ ／ Ｅ ， ￣避 光 孵 育 ３ ０ １ ｓ ｍ ） ４Ｃ Ｏ
图像分 析系 统扫 描并 读取 灰度 值 。计 算 Ｇ Ｉ Ｌ ／ Ｐ —Ｐ Ｄ
Ｂ— ｃｎ ｕ Ａ ／ ａｔ 、Ｐ Ｒ ￣一ａｔ 光 密 度 ， 行 半 定 量 分 析 。 ｉ ｃｎ ｉ 进
所有实验均独立做 ３次 ， 取平均值 。
１ ３ 免 疫 印 迹 法 （ ｓｅｎ Ｂｏ ） 测 细 胞 Ｇ Ｉ—Ｐ Ｄ ． Ｗｅｔｒ ｌｔ 检 Ｐ Ｌ
所 有 实 验均 独 立做 ３次 ， 平 均 值 。 取
１ ５ 细 胞 黏 附 功 能 检 测 用 含 ２ ｇ ｍＬ人 Ｆ 的 ． ０ ／ ｎ
ｌ ２ ３
ＰＳ 被 ９ Ｂ 包 ６孔 板 ，０ Ｉ 孔 ，℃ 过 夜 。 实 验 前 用 ２ ５ ／ ４ ％ Ｂ Ａ 的 Ｒ ＭＩ ６０培 养 基 ３ ℃ 阻 断 ２ｈ Ｐ Ｓ ３次 ， Ｓ Ｐ ４ １ ７ ，Ｂ 洗 将 细胞 悬 浮 于 黏 附 缓 冲 液 中 （ ０ ５ Ｂ Ａ 的 Ｒ ＭＩ 含 ．％ Ｓ Ｐ １４ ） 调 细 胞 浓 度 为 ５×１ ｍ ， 入 ９ ６０ ， ０／ Ｌ 加 ６孔 板 ， ０ １０ Ｌ 孔 。实 验 共 分 ２组 ： 组 总 细 胞 组 ； ／ Ａ Ｂ组 为 黏 附 细 胞 组 ； 组 平 行 设 ３孔 。３ ￣ 附 １ｈ 吸 去 Ｂ组 缓 冲 每 ７Ｃ黏 ， 液 和 非 黏 附细 胞 ， 用 黏 附缓 冲液 轻 洗 ３次 ， 量 除 去 并 尽 所 有 非 黏 附细 胞 。１０ ｐ ０ ． Ｌ细胞 悬 液 中加 入 ２ ＬＭＴ ０ Ｆ
Ｍ ： ０ ｐ ＤＮＡ ｒ ｅ ；１： ６ １０ｂ ｍａ ｋ ｒ Ｋ５ ２；２： ＨＬ 一６ ０；３： ＨＰ一１ Ｔ
图 １ 髓 性 白血 病 细胞 株 中 Ｇ Ｉ Ｌ Ｐ —Ｐ Ｄ和 ｕ Ａ Ｎ 的表 达 Ｐ Ｒ ｍＲ Ａ
２２ Ｇ Ｉ Ｌ ． Ｐ —Ｐ Ｄ蛋 白表 达 水 平
Ｔ ＨＰ—ｌ细 胞 中 Ｇ Ｉ Ｐ— Ｐ Ｄ蛋 白表 达 水 平 较 高 ， 著 高 于 Ｋ ６ 、 Ｌ一６ Ｌ 显 ５２ Ｈ ０细
组 。而白血病细胞 的黏附与迁移能力是否与 Ｇ Ｉ Ｐ— Ｐ Ｄ及 Ｇ Ｉ Ｌ Ｐ 锚定 黏附分 子如 ｕ Ａ Ｐ Ｒ等 的表 达相关 ， 我 们 尚未明确 。２Ｏ 年 ｌ ０６ ０月至 ２０ ０７年 ４月 ， 本研究拟 比
较髓 性 白血 病细 胞 Ｋ ６ 、 Ｌ一 ０和 Ｔ Ｐ一１ 黏 附 、 ５ ２Ｈ ６ Ｈ 的 侵
表 达。结果
ｒ Ｐ一１ Ｉ ＇ Ｈ 细胞 中 Ｇ Ｉ Ｐ Ｄ和 ｕ Ａ Ｐ—Ｌ Ｐ Ｒ的 ｍ Ｎ Ｒ Ａ及蛋 白质表 达水平均明显 高于 Ｋ ６ ５ ２和 Ｈ ６ Ｌ一 ０细胞。
Ｔ Ｐ一１ 胞 较 Ｋ ６ Ｈ 细 ５２和 Ｈ ６ Ｌ一 ０细胞 具 有 较 高 的黏 附和 侵 袭 能 力 ， 与其 Ｇ Ｉ Ｐ Ｄ和 锚 定 蛋 白 Ｐ— Ｌ
广东医学
２ １ 年 １月 第 ３ ０１ ２卷第 ２期
Ｇ ａ ｇ ｏ ｇＭｅ ｉ ｌ ｏ ｒａ Ｊｎ ０ １ ｏ．３ Ｎｏ ２ ｕ ｎ ｄ ｎ ｄｃ ｕ ｎ ｌ ａ ．２ １ ，Ｖ １ ２， ． ａＪ
Ｍ ｌ ２ ３ Ｍ ｌ ２ ３
Ｍ
・
ｌ５・ ５
洗涤后用 １ ％多 聚 甲醛 固定 。流式 细胞 仪分 析 检测 。
胞 ， 异 有 统 计 学 意 义 （ Ｐ＜ ． １ ， Ｋ ６ 差 均 ０ ０ ） 而 ５ ２和 Ｈ Ｌ一 ６ ０细 胞 中 Ｇ Ｉ Ｌ 蛋 白表 达 较 弱 ， 者 比较 差 异 无 Ｐ —Ｐ Ｄ 两
（ ｇ ｐ ） ３ ｏ 孵 育 ４ｈ 去上 清 ， Ｄ Ｏ ２０ Ｌ ５ｍ ／ ． ，７Ｃ Ｌ ， 加 ＭＳ ０ ／ 孔， 振荡 混匀 ， ４ ０型酶标 仪测 量 ５ ０ｎ 用 ５ ７ ｍ处 的吸 光 度 。所 有实验均独立做 ３次 ， 取平均值 。计 算公式 ： 黏 附率 （ ） ％ ：Ａ黏附细胞／ Ａ总细胞 ×１０ ０ ％
的表 达 按 Ｔ Ｉｏ 试 剂 盒 说 明 提 取 Ｒ Ｒ ｚｌ ＮＡ。通 过 甲 醛
｝国家 自然 科 学 基 金 资助 项 目（ 号 ：０７ ７ ３ 编 ３５ ０ ８ ）
＆２ ０ －２ ０ ０４ ０ ７年 中南 大 学湘 雅 医 院 博 士研 究 生
ｍｎ Ｐ Ｓ洗涤除去 多余抗体 ； ｉ ，Ｂ 然后加 入 １ Ｌ羊抗 小 ０Ｉ 上 鼠 Ｉ ／ ＩＣ ０ １ｍ ／ Ｌ 于 ４ ｇ ＦＴ （ ． ｇｍ ） ℃避光孵育 ３ ｉ ， Ｂ Ｇ ０ｍｎ Ｐ Ｓ
变性凝胶电泳检查 Ｒ Ａ有无降解 ， Ｎ 用紫外分光光度仪 测吸光度 （ 值 ， Ａ ６ ／ ２ ０比值 计算 Ｒ Ａ纯度和 Ａ） 以 ２ ０ Ａ ８ Ｎ 浓度 ； 将所提 Ｒ Ａ进行逆转录及 Ｐ Ｒ扩增。引物 由上 Ｎ Ｃ
润骨髓 、 、 肝 脾及淋 巴结等器官。白血病髓外浸润往往 是 白血病治疗缓解后 复发和死亡 的主要 原因之一 ， 黏 附和迁移是其中最重要 的步骤。白血病细胞髓外浸润 的机制至今尚不清楚 。越来越多 的研究认为 白血病细 胞髓外 浸 润 与 白血 病 细 胞 表 面 表 达 的黏 附 分 子 相
Ａ Ｃ 一 扩 增 产 物 长 度 为 ４ ６ｂ 。 Ｔ Ｃ ３， ９ ｐ ｕ Ａ 引 物 序 列 ： 一Ｃ Ｃ Ｇ Ｇ Ｔ Ｃ ｒ Ａｒ Ｇ ＰＲ ５ Ｃ Ａ Ｃ Ｇ Ａ Ｇ Ｃ一 Ａ
３， Ａ Ｔ ｃ Ｔ ｃ Ａ Ｇ Ｔ Ｇ Ｇ ３， ５ 一 Ａ ｃ Ｔ Ｇ ｃ Ａ Ｇ Ｇ Ｔ Ｇ一 扩增产 物长
袭能力 ， 并探讨其与 Ｇ Ｉ Ｌ ｕＡ Ｐ —Ｐ Ｄ、 Ｒ表达的关系。 Ｐ
１ 材 料 与方 法
的表达
蛋 白的提取 按文献 ［２ 所提供 的方法进行 。 １］
取 ６ ｇ蛋 白 的样 本 进 行 Ｓ Ｓ— Ａ Ｅ 电泳 ， 后 采 用 Ｏ Ｄ ＰＧ 然 湿 转 法 转 到 Ｐ Ｄ 膜 上 。用 含 有 ５ ／ Ｖ Ｆ ０ｇＬ奶 粉 的 Ｔ Ｓ封 Ｂ
宋奎 ， 晓 军 许 ，陈方 平
‘ 东 省 中 山市人 民 医院 血 液 科 （２４ ３ ； 中南 大 学湘 雅 医院 血 液科 （ 沙 ４０ ０ ） 广 ５ ８０ ） 长 １０ ８
【 摘要 】 目的 比较髓性 白血病细胞 Ｋ ６ 、 Ｌ一６ ５２Ｈ ０和 பைடு நூலகம் Ｐ一１ 附、 Ｈ 黏 迁移 能力以及糖基化磷 脂酰肌 醇特 异
实验 和 体 外 穿膜 实验 比 较 ３种 不 同 白 血 病 细 胞 的 黏 附 性 和 侵 袭 性 ； 定 量 Ｒ 半 Ｔ—Ｐ Ｒ 检 测 这 些 白 血 病 细 胞 Ｃ Ｇ Ｉ Ｐ Ｄ ｕＡ Ｎ 的表 达 水 平 ； 疫 印 迹 法检 测 细 胞 Ｇ Ｉ Ｌ 的 表 达 ； 式 细胞 术 检 测 细胞 膜 ｕ Ａ 的 Ｐ — Ｌ 和 Ｐ Ｒ ｍＲ Ａ 免 Ｐ —Ｐ Ｄ 流 ＰＲ
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广 东医 学
２１ ０ １年 １ 第 ３ 月 ２卷 第 ２期
Ｇ ａ ｇ ｏ ｇＭ ｅｉａ Ｊ ｕ ｎｌ Ｊｎ ０ １ Ｖ １ ２ ｏ ｕ ｎ ｄ ｎ ｄｃｌ ｏ ｒ ａ ａ．２ １ ， ｏ．３ ，Ｎ ．２
糖 基 化磷脂 酰肌 醇特 异性 磷 脂 酶 Ｄ的表 达 与 白血病 细 胞 黏 附和侵 袭性 的关 系
度为 ４ ５ｂ 。取扩增 产物 ５ ５ ｐ ， １５ 琼脂糖胶 在 用 ．％
８ 电 压 下 电 泳 ４ ５Ｖ ５～６ ｉ 。采 用 Ｉ ａ ｅ ｓ ｒＤ Ｓ ０ ｍｎ ｍ ｇ ｍａｔ Ｖ ｅ
中起着重要作用 ， 其表达水平与其恶性表型相关
。
我 们 以前 的研 究 发 现 ， 性 髓 性 白血 病 组 骨 髓 单 个 核 急 细胞 Ｇ Ｉ Ｐ Ｄ 性 和 ｍ Ｎ 的 表 达 均 高 于 正 常 对 照 Ｐ—Ｌ活 Ｒ Ａ
１６ 体 外 穿膜 实验 ． 参考 Ｅ Ｇ Ｒ Ｎ Ｅ Ｓ等 的 方 法 ， 并
显著性 （ ０ ０ ） 见 图 ２ 表 １ Ｐ＞ ．５ ， ， 。
ＧＰ． １ＰＬＤ
ＧＡ Ｐ Ｈ Ｄ
作适 当修改 。采用直径 ６ ５ｍ 孔径 ８ ． ｍ、 ｍ的 ｔ ｎｗ ｌ ｒ ｓｅ ａ ｌ
板 ， 上 铺 ５ｍ ／ ＬＥ Ｍ 胶 ５ Ｌ 用 Ｒ Ｍ ６ ０稀 膜 ｇｍ Ｃ Ｏ （ Ｐ Ｉ１４ 释 ） ３ ℃ ３ ｉ 胶 。调 整 细 胞 浓 度 为 ２×１。ｍ ， ，７ ０ｍ ｎ成 ０／ Ｌ 取 １０ Ｌ细 胞 悬 液 加 入 上 层 ， 层 加 入 无 血 清 Ｒ ＭＩ ０ 下 Ｐ １４ ６ ０培 养 基 ６０ （ Ｆ Ｏ ｇｍ ） 培 养 于 ３ ￣ ０ 含 ｎ １ ／ Ｌ ， ７Ｃ、 ５ Ｃ ， 件 下 ２ 。取 出滤 膜 ，％ 多 聚 甲醛 于 ４ 固 ％ Ｏ条 ４ｈ ４ ℃ 定膜 ３ ｉ，Ｂ 洗 ２次 ， 人 ０ １ ０ｒｎ Ｐ Ｓ ａ 加 ． ％结 晶紫 染 色 ， 棉 用 签 仔 细 擦 掉 位 于 膜 内表 面 的 未 穿 过 膜 的 细 胞 ， 倍 镜 高 下 （× ０ ） 数 膜 背 面 ５个 视 野 的 细 胞 数 ， 算 出每 个 ４０ 计 计
核细 胞 白血 病 细 胞 株 Ｔ Ｐ一１细 胞 均 为 本 科 室 自存 。 Ｈ
细胞培养于含 １ ％ 小牛血清 的 Ｒ Ｍ １４ ０ Ｐ Ｉ６０培 养基 中，
于 ３ ℃ 、％Ｃ 饱 和 湿 度条 件 下 培 养 。 ７ ５ Ｏ、
１ ２ Ｒ —Ｐ Ｒ 检 坝 细 胞 中 Ｇ Ｉ Ｌ ｕ ＡＲ ｍＲＮ ． Ｔ Ｃ ４ Ｐ —Ｐ Ｄ、 Ｐ Ａ
Ｔ Ｐ一１细胞 对 Ｆ Ｈ ｎ的 黏 附率 显 著 高 于 Ｋ ６ 、 Ｌ一 ０细胞 ； Ｈ ５２ Ｈ ６ Ｔ Ｐ一１与 Ｈ ６ 细胞 体 外 穿 膜 侵 袭 能 力 显 著 高 于 Ｌ一 ０ ｌ６ （ ２细胞 。结 论 ５ ｕＡ Ｐ Ｒ表 达 有 关。
【 关键词 】 Ｇ Ｉ Ｐ Ｄ 白血病细胞 ； 附； Ｐ— Ｌ ； 黏 迁移 白血病 是 血 液 系统 的恶 性 克 隆性 疾 病 ， 广 泛 浸 可
１ １ 细胞培养 ．
人慢 性粒细胞性 白血病 急变细胞株
闭 ２ｈ加 入 Ｇ Ｉ Ｌ ， Ｐ —Ｐ Ｄ一抗 室温 孵 育 １ｈ １ ５０稀 （ ：０
释）Ｔ Ｓ ，Ｂ Ｔ漂 洗 ３次 后 用 辣 根 过 氧 化 物 酶 标 记 的二 抗
Ｋ ６ 、 性 粒 细胞 白血 病 细 胞 株 ＨＬ一６ ５２ 急 ０细 胞 ， 性 单 急
关 。 已有 的研 究 表 明 急性 髓 性 白血 病 患 者 中 普 遍
海英骏生物 公 司合成 ， 内参照 ｐ—ａｔ ｃｎ引物 序列 ： ｉ 上
游 ： 一 ，Ｉ Ｃ Ｃ ＧＣ Ｃ Ｔ Ｔ Ｃ 一３ ， 游 ： 一 ５ ＩＴ Ａ Ｇ Ｔ Ｃ Ａ Ｙ Ａ Ｔｒ 下 ５
Ｔｑ Ａ Ｔ Ａ Ｇ Ａ Ｇ Ａ Ｔ Ａ 一３， 增 产 物 长 度 为 ｌ＇ Ｇ Ｙ Ｇ Ｇ Ｔ Ｔ Ｇ Ｃ Ｃ 扩 ２ ３ ｂ 。Ｇ Ｉ Ｌ 引 物 序 列 ： 游 ： 一 Ｃ Ａ － ７ ｐ Ｐ—Ｐ Ｄ 上 ５ Ｃ Ｃ
ＧＡ ＡＣ Ａ Ｃ Ｔ Ａ Ｔ Ｃ 一３ ， 游 ： 一Ｔ Ａ ＡＣ Ｃ Ａ Ｔ Ｃ Ｔ Ｃ ＡＣ Ｃ 下 ５ ＣＴ Ｔ．
过表达 Ｇ Ｉ Ｐ 锚定黏附分子 ｕ Ａ 高表 达 ｕ Ａ Ｐ Ｒ， Ｐ Ｒ的急性 白血病患者常出现肝 、 、 脾 皮肤和黏膜等 白血病 细胞髓 外组织浸 润 。研究 证实 ， 糖基化 磷脂 酰肌 醇特异 性磷脂酶 Ｄ（ Ｐ —Ｐ Ｄ） Ｇ Ｉ Ｌ 在肿瘤 细胞浸 润及转 移过程
室温孵育 ２ｈ Ｔ Ｓ ， Ｂ Ｔ漂洗 ３次后 Ｅ Ｌ法暗室 中曝光 ， Ｃ 显 影 。选用 Ｇ Ｐ Ｈ 上海康成 ） ＡＤ （ 作为内参 ，： ０ １２０ ０稀释。
１４ 流 式 细胞 术 检 测 细 胞 膜 锚 定 蛋 白 ｕＡ 的 表 达 ． ＰＲ 取 ３×１’ ５２ Ｈ ０ Ｋ ６ 、 Ｌ一 ０ Ｔ Ｐ—ｌ细 胞 ， 入 ｌ Ｌ ６ 、Ｈ 加 ０ 小 鼠抗人 的 ｕ Ａ Ｐ Ｒ单 抗 （ ． ｍ ／ Ｅ ， ￣避 光 孵 育 ３ ０ １ ｓ ｍ ） ４Ｃ Ｏ
图像分 析系 统扫 描并 读取 灰度 值 。计 算 Ｇ Ｉ Ｌ ／ Ｐ —Ｐ Ｄ
Ｂ— ｃｎ ｕ Ａ ／ ａｔ 、Ｐ Ｒ ￣一ａｔ 光 密 度 ， 行 半 定 量 分 析 。 ｉ ｃｎ ｉ 进
所有实验均独立做 ３次 ， 取平均值 。
１ ３ 免 疫 印 迹 法 （ ｓｅｎ Ｂｏ ） 测 细 胞 Ｇ Ｉ—Ｐ Ｄ ． Ｗｅｔｒ ｌｔ 检 Ｐ Ｌ
所 有 实 验均 独 立做 ３次 ， 平 均 值 。 取
１ ５ 细 胞 黏 附 功 能 检 测 用 含 ２ ｇ ｍＬ人 Ｆ 的 ． ０ ／ ｎ
ｌ ２ ３
ＰＳ 被 ９ Ｂ 包 ６孔 板 ，０ Ｉ 孔 ，℃ 过 夜 。 实 验 前 用 ２ ５ ／ ４ ％ Ｂ Ａ 的 Ｒ ＭＩ ６０培 养 基 ３ ℃ 阻 断 ２ｈ Ｐ Ｓ ３次 ， Ｓ Ｐ ４ １ ７ ，Ｂ 洗 将 细胞 悬 浮 于 黏 附 缓 冲 液 中 （ ０ ５ Ｂ Ａ 的 Ｒ ＭＩ 含 ．％ Ｓ Ｐ １４ ） 调 细 胞 浓 度 为 ５×１ ｍ ， 入 ９ ６０ ， ０／ Ｌ 加 ６孔 板 ， ０ １０ Ｌ 孔 。实 验 共 分 ２组 ： 组 总 细 胞 组 ； ／ Ａ Ｂ组 为 黏 附 细 胞 组 ； 组 平 行 设 ３孔 。３ ￣ 附 １ｈ 吸 去 Ｂ组 缓 冲 每 ７Ｃ黏 ， 液 和 非 黏 附细 胞 ， 用 黏 附缓 冲液 轻 洗 ３次 ， 量 除 去 并 尽 所 有 非 黏 附细 胞 。１０ ｐ ０ ． Ｌ细胞 悬 液 中加 入 ２ ＬＭＴ ０ Ｆ
Ｍ ： ０ ｐ ＤＮＡ ｒ ｅ ；１： ６ １０ｂ ｍａ ｋ ｒ Ｋ５ ２；２： ＨＬ 一６ ０；３： ＨＰ一１ Ｔ
图 １ 髓 性 白血 病 细胞 株 中 Ｇ Ｉ Ｌ Ｐ —Ｐ Ｄ和 ｕ Ａ Ｎ 的表 达 Ｐ Ｒ ｍＲ Ａ
２２ Ｇ Ｉ Ｌ ． Ｐ —Ｐ Ｄ蛋 白表 达 水 平
Ｔ ＨＰ—ｌ细 胞 中 Ｇ Ｉ Ｐ— Ｐ Ｄ蛋 白表 达 水 平 较 高 ， 著 高 于 Ｋ ６ 、 Ｌ一６ Ｌ 显 ５２ Ｈ ０细
组 。而白血病细胞 的黏附与迁移能力是否与 Ｇ Ｉ Ｐ— Ｐ Ｄ及 Ｇ Ｉ Ｌ Ｐ 锚定 黏附分 子如 ｕ Ａ Ｐ Ｒ等 的表 达相关 ， 我 们 尚未明确 。２Ｏ 年 ｌ ０６ ０月至 ２０ ０７年 ４月 ， 本研究拟 比
较髓 性 白血 病细 胞 Ｋ ６ 、 Ｌ一 ０和 Ｔ Ｐ一１ 黏 附 、 ５ ２Ｈ ６ Ｈ 的 侵
表 达。结果
ｒ Ｐ一１ Ｉ ＇ Ｈ 细胞 中 Ｇ Ｉ Ｐ Ｄ和 ｕ Ａ Ｐ—Ｌ Ｐ Ｒ的 ｍ Ｎ Ｒ Ａ及蛋 白质表 达水平均明显 高于 Ｋ ６ ５ ２和 Ｈ ６ Ｌ一 ０细胞。
Ｔ Ｐ一１ 胞 较 Ｋ ６ Ｈ 细 ５２和 Ｈ ６ Ｌ一 ０细胞 具 有 较 高 的黏 附和 侵 袭 能 力 ， 与其 Ｇ Ｉ Ｐ Ｄ和 锚 定 蛋 白 Ｐ— Ｌ
广东医学
２ １ 年 １月 第 ３ ０１ ２卷第 ２期
Ｇ ａ ｇ ｏ ｇＭｅ ｉ ｌ ｏ ｒａ Ｊｎ ０ １ ｏ．３ Ｎｏ ２ ｕ ｎ ｄ ｎ ｄｃ ｕ ｎ ｌ ａ ．２ １ ，Ｖ １ ２， ． ａＪ
Ｍ ｌ ２ ３ Ｍ ｌ ２ ３
Ｍ
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ｌ５・ ５
洗涤后用 １ ％多 聚 甲醛 固定 。流式 细胞 仪分 析 检测 。
胞 ， 异 有 统 计 学 意 义 （ Ｐ＜ ． １ ， Ｋ ６ 差 均 ０ ０ ） 而 ５ ２和 Ｈ Ｌ一 ６ ０细 胞 中 Ｇ Ｉ Ｌ 蛋 白表 达 较 弱 ， 者 比较 差 异 无 Ｐ —Ｐ Ｄ 两
（ ｇ ｐ ） ３ ｏ 孵 育 ４ｈ 去上 清 ， Ｄ Ｏ ２０ Ｌ ５ｍ ／ ． ，７Ｃ Ｌ ， 加 ＭＳ ０ ／ 孔， 振荡 混匀 ， ４ ０型酶标 仪测 量 ５ ０ｎ 用 ５ ７ ｍ处 的吸 光 度 。所 有实验均独立做 ３次 ， 取平均值 。计 算公式 ： 黏 附率 （ ） ％ ：Ａ黏附细胞／ Ａ总细胞 ×１０ ０ ％
的表 达 按 Ｔ Ｉｏ 试 剂 盒 说 明 提 取 Ｒ Ｒ ｚｌ ＮＡ。通 过 甲 醛
｝国家 自然 科 学 基 金 资助 项 目（ 号 ：０７ ７ ３ 编 ３５ ０ ８ ）
＆２ ０ －２ ０ ０４ ０ ７年 中南 大 学湘 雅 医 院 博 士研 究 生
ｍｎ Ｐ Ｓ洗涤除去 多余抗体 ； ｉ ，Ｂ 然后加 入 １ Ｌ羊抗 小 ０Ｉ 上 鼠 Ｉ ／ ＩＣ ０ １ｍ ／ Ｌ 于 ４ ｇ ＦＴ （ ． ｇｍ ） ℃避光孵育 ３ ｉ ， Ｂ Ｇ ０ｍｎ Ｐ Ｓ
变性凝胶电泳检查 Ｒ Ａ有无降解 ， Ｎ 用紫外分光光度仪 测吸光度 （ 值 ， Ａ ６ ／ ２ ０比值 计算 Ｒ Ａ纯度和 Ａ） 以 ２ ０ Ａ ８ Ｎ 浓度 ； 将所提 Ｒ Ａ进行逆转录及 Ｐ Ｒ扩增。引物 由上 Ｎ Ｃ
润骨髓 、 、 肝 脾及淋 巴结等器官。白血病髓外浸润往往 是 白血病治疗缓解后 复发和死亡 的主要 原因之一 ， 黏 附和迁移是其中最重要 的步骤。白血病细胞髓外浸润 的机制至今尚不清楚 。越来越多 的研究认为 白血病细 胞髓外 浸 润 与 白血 病 细 胞 表 面 表 达 的黏 附 分 子 相
Ａ Ｃ 一 扩 增 产 物 长 度 为 ４ ６ｂ 。 Ｔ Ｃ ３， ９ ｐ ｕ Ａ 引 物 序 列 ： 一Ｃ Ｃ Ｇ Ｇ Ｔ Ｃ ｒ Ａｒ Ｇ ＰＲ ５ Ｃ Ａ Ｃ Ｇ Ａ Ｇ Ｃ一 Ａ
３， Ａ Ｔ ｃ Ｔ ｃ Ａ Ｇ Ｔ Ｇ Ｇ ３， ５ 一 Ａ ｃ Ｔ Ｇ ｃ Ａ Ｇ Ｇ Ｔ Ｇ一 扩增产 物长
袭能力 ， 并探讨其与 Ｇ Ｉ Ｌ ｕＡ Ｐ —Ｐ Ｄ、 Ｒ表达的关系。 Ｐ
１ 材 料 与方 法
的表达
蛋 白的提取 按文献 ［２ 所提供 的方法进行 。 １］
取 ６ ｇ蛋 白 的样 本 进 行 Ｓ Ｓ— Ａ Ｅ 电泳 ， 后 采 用 Ｏ Ｄ ＰＧ 然 湿 转 法 转 到 Ｐ Ｄ 膜 上 。用 含 有 ５ ／ Ｖ Ｆ ０ｇＬ奶 粉 的 Ｔ Ｓ封 Ｂ
宋奎 ， 晓 军 许 ，陈方 平
‘ 东 省 中 山市人 民 医院 血 液 科 （２４ ３ ； 中南 大 学湘 雅 医院 血 液科 （ 沙 ４０ ０ ） 广 ５ ８０ ） 长 １０ ８
【 摘要 】 目的 比较髓性 白血病细胞 Ｋ ６ 、 Ｌ一６ ５２Ｈ ０和 பைடு நூலகம் Ｐ一１ 附、 Ｈ 黏 迁移 能力以及糖基化磷 脂酰肌 醇特 异