糖基化磷脂酰肌醇特异性磷脂酶D的表达与白血病细胞黏附和侵袭性的关系

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性磷脂酶 D( P —P D) G I L 的表 达, 讨 G I L 探 P —P D表达与不同白血病细胞黏附性 、 迁移性的关系。方法 采用黏 附
实验 和 体 外 穿膜 实验 比 较 3种 不 同 白 血 病 细 胞 的 黏 附 性 和 侵 袭 性 ; 定 量 R 半 T—P R 检 测 这 些 白 血 病 细 胞 C G I P D uA N 的表 达 水 平 ; 疫 印 迹 法检 测 细 胞 G I L 的 表 达 ; 式 细胞 术 检 测 细胞 膜 u A 的 P — L 和 P R mR A 免 P —P D 流 PR

14・ 5
广 东医 学
21 0 1年 1 第 3 月 2卷 第 2期
G a g o gM eia J u nl Jn 0 1 V 1 2 o u n d n dcl o r a a.2 1 , o.3 ,N .2
糖 基 化磷脂 酰肌 醇特 异性 磷 脂 酶 D的表 达 与 白血病 细 胞 黏 附和侵 袭性 的关 系
度为 4 5b 。取扩增 产物 5 5 p , 15 琼脂糖胶 在 用 .%
8 电 压 下 电 泳 4 5V 5~6 i 。采 用 I a e s rD S 0 mn m g mat V e
中起着重要作用 , 其表达水平与其恶性表型相关

我 们 以前 的研 究 发 现 , 性 髓 性 白血 病 组 骨 髓 单 个 核 急 细胞 G I P D 性 和 m N 的 表 达 均 高 于 正 常 对 照 P—L活 R A
16 体 外 穿膜 实验 . 参考 E G R N E S等 的 方 法 , 并
显著性 ( 0 0 ) 见 图 2 表 1 P> .5 , , 。
GP. 1PLD
GA P H D
作适 当修改 。采用直径 6 5m 孔径 8 . m、 m的 t nw l r se a l
板 , 上 铺 5m / LE M 胶 5 L 用 R M 6 0稀 膜 gm C O ( P I14 释 ) 3 ℃ 3 i 胶 。调 整 细 胞 浓 度 为 2×1。m , ,7 0m n成 0/ L 取 10 L细 胞 悬 液 加 入 上 层 , 层 加 入 无 血 清 R MI 0 下 P 14 6 0培 养 基 60 ( F O gm ) 培 养 于 3  ̄ 0 含 n 1 / L , 7C、 5 C , 件 下 2 。取 出滤 膜 ,% 多 聚 甲醛 于 4 固 % O条 4h 4 ℃ 定膜 3 i,B 洗 2次 , 人 0 1 0rn P S a 加 . %结 晶紫 染 色 , 棉 用 签 仔 细 擦 掉 位 于 膜 内表 面 的 未 穿 过 膜 的 细 胞 , 倍 镜 高 下 (× 0 ) 数 膜 背 面 5个 视 野 的 细 胞 数 , 算 出每 个 40 计 计
核细 胞 白血 病 细 胞 株 T P一1细 胞 均 为 本 科 室 自存 。 H
细胞培养于含 1 % 小牛血清 的 R M 14 0 P I60培 养基 中,
于 3 ℃ 、%C 饱 和 湿 度条 件 下 培 养 。 7 5 O、
1 2 R —P R 检 坝 细 胞 中 G I L u AR mRN . T C 4 P —P D、 P A
T P一1细胞 对 F H n的 黏 附率 显 著 高 于 K 6 、 L一 0细胞 ; H 52 H 6 T P一1与 H 6 细胞 体 外 穿 膜 侵 袭 能 力 显 著 高 于 L一 0 l6 ( 2细胞 。结 论 5 uA P R表 达 有 关。
【 关键词 】 G I P D 白血病细胞 ; 附; P— L ; 黏 迁移 白血病 是 血 液 系统 的恶 性 克 隆性 疾 病 , 广 泛 浸 可
1 1 细胞培养 .
人慢 性粒细胞性 白血病 急变细胞株
闭 2h加 入 G I L , P —P D一抗 室温 孵 育 1h 1 50稀 ( :0
释)T S ,B T漂 洗 3次 后 用 辣 根 过 氧 化 物 酶 标 记 的二 抗
K 6 、 性 粒 细胞 白血 病 细 胞 株 HL一6 52 急 0细 胞 , 性 单 急
关 。 已有 的研 究 表 明 急性 髓 性 白血 病 患 者 中 普 遍
海英骏生物 公 司合成 , 内参照 p—at cn引物 序列 : i 上
游 : 一 ,I C C GC C T T C 一3 , 游 : 一 5 IT A G T C A Y A Tr 下 5
Tq A T A G A G A T A 一3, 增 产 物 长 度 为 l' G Y G G T T G C C 扩 2 3 b 。G I L 引 物 序 列 : 游 : 一 C A - 7 p P—P D 上 5 C C
GA AC A C T A T C 一3 , 游 : 一T A AC C A T C T C AC C 下 5 CT T.
过表达 G I P 锚定黏附分子 u A 高表 达 u A P R, P R的急性 白血病患者常出现肝 、 、 脾 皮肤和黏膜等 白血病 细胞髓 外组织浸 润 。研究 证实 , 糖基化 磷脂 酰肌 醇特异 性磷脂酶 D( P —P D) G I L 在肿瘤 细胞浸 润及转 移过程
室温孵育 2h T S , B T漂洗 3次后 E L法暗室 中曝光 , C 显 影 。选用 G P H 上海康成 ) AD ( 作为内参 ,: 0 120 0稀释。
14 流 式 细胞 术 检 测 细 胞 膜 锚 定 蛋 白 uA 的 表 达 . PR 取 3×1’ 52 H 0 K 6 、 L一 0 T P—l细 胞 , 入 l L 6 、H 加 0 小 鼠抗人 的 u A P R单 抗 ( . m / E ,  ̄避 光 孵 育 3 0 1 s m ) 4C O
图像分 析系 统扫 描并 读取 灰度 值 。计 算 G I L / P —P D
B— cn u A / at 、P R  ̄一at 光 密 度 , 行 半 定 量 分 析 。 i cn i 进
所有实验均独立做 3次 , 取平均值 。
1 3 免 疫 印 迹 法 ( sen Bo ) 测 细 胞 G I—P D . Wetr lt 检 P L
所 有 实 验均 独 立做 3次 , 平 均 值 。 取
1 5 细 胞 黏 附 功 能 检 测 用 含 2 g mL人 F 的 . 0 / n
l 2 3
PS 被 9 B 包 6孔 板 ,0 I 孔 ,℃ 过 夜 。 实 验 前 用 2 5 / 4 % B A 的 R MI 60培 养 基 3 ℃ 阻 断 2h P S 3次 , S P 4 1 7 ,B 洗 将 细胞 悬 浮 于 黏 附 缓 冲 液 中 ( 0 5 B A 的 R MI 含 .% S P 14 ) 调 细 胞 浓 度 为 5×1 m , 入 9 60 , 0/ L 加 6孔 板 , 0 10 L 孔 。实 验 共 分 2组 : 组 总 细 胞 组 ; / A B组 为 黏 附 细 胞 组 ; 组 平 行 设 3孔 。3  ̄ 附 1h 吸 去 B组 缓 冲 每 7C黏 , 液 和 非 黏 附细 胞 , 用 黏 附缓 冲液 轻 洗 3次 , 量 除 去 并 尽 所 有 非 黏 附细 胞 。10 p 0 . L细胞 悬 液 中加 入 2 LMT 0 F
M : 0 p DNA r e ;1: 6 10b ma k r K5 2;2: HL 一6 0;3: HP一1 T
图 1 髓 性 白血 病 细胞 株 中 G I L P —P D和 u A N 的表 达 P R mR A
22 G I L . P —P D蛋 白表 达 水 平
T HP—l细 胞 中 G I P— P D蛋 白表 达 水 平 较 高 , 著 高 于 K 6 、 L一6 L 显 52 H 0细
组 。而白血病细胞 的黏附与迁移能力是否与 G I P— P D及 G I L P 锚定 黏附分 子如 u A P R等 的表 达相关 , 我 们 尚未明确 。2O 年 l 06 0月至 20 07年 4月 , 本研究拟 比
较髓 性 白血 病细 胞 K 6 、 L一 0和 T P一1 黏 附 、 5 2H 6 H 的 侵
表 达。结果
r P一1 I ' H 细胞 中 G I P D和 u A P—L P R的 m N R A及蛋 白质表 达水平均明显 高于 K 6 5 2和 H 6 L一 0细胞。
T P一1 胞 较 K 6 H 细 52和 H 6 L一 0细胞 具 有 较 高 的黏 附和 侵 袭 能 力 , 与其 G I P D和 锚 定 蛋 白 P— L
广东医学
2 1 年 1月 第 3 01 2卷第 2期
G a g o gMe i l o ra Jn 0 1 o.3 No 2 u n d n dc u n l a .2 1 ,V 1 2, . aJ
M l 2 3 M l 2 3


l5・ 5
洗涤后用 1 %多 聚 甲醛 固定 。流式 细胞 仪分 析 检测 。
胞 , 异 有 统 计 学 意 义 ( P< . 1 , K 6 差 均 0 0 ) 而 5 2和 H L一 6 0细 胞 中 G I L 蛋 白表 达 较 弱 , 者 比较 差 异 无 P —P D 两
( g p ) 3 o 孵 育 4h 去上 清 , D O 20 L 5m / . ,7C L , 加 MS 0 / 孔, 振荡 混匀 , 4 0型酶标 仪测 量 5 0n 用 5 7 m处 的吸 光 度 。所 有实验均独立做 3次 , 取平均值 。计 算公式 : 黏 附率 ( ) % :A黏附细胞/ A总细胞 ×10 0 %
的表 达 按 T Io 试 剂 盒 说 明 提 取 R R zl NA。通 过 甲 醛
}国家 自然 科 学 基 金 资助 项 目( 号 :07 7 3 编 35 0 8 )
&2 0 -2 0 04 0 7年 中南 大 学湘 雅 医 院 博 士研 究 生
mn P S洗涤除去 多余抗体 ; i ,B 然后加 入 1 L羊抗 小 0I 上 鼠 I / IC 0 1m / L 于 4 g FT ( . gm ) ℃避光孵育 3 i , B G 0mn P S
变性凝胶电泳检查 R A有无降解 , N 用紫外分光光度仪 测吸光度 ( 值 , A 6 / 2 0比值 计算 R A纯度和 A) 以 2 0 A 8 N 浓度 ; 将所提 R A进行逆转录及 P R扩增。引物 由上 N C
润骨髓 、 、 肝 脾及淋 巴结等器官。白血病髓外浸润往往 是 白血病治疗缓解后 复发和死亡 的主要 原因之一 , 黏 附和迁移是其中最重要 的步骤。白血病细胞髓外浸润 的机制至今尚不清楚 。越来越多 的研究认为 白血病细 胞髓外 浸 润 与 白血 病 细 胞 表 面 表 达 的黏 附 分 子 相
A C 一 扩 增 产 物 长 度 为 4 6b 。 T C 3, 9 p u A 引 物 序 列 : 一C C G G T C r Ar G PR 5 C A C G A G C一 A
3, A T c T c A G T G G 3, 5 一 A c T G c A G G T G一 扩增产 物长
袭能力 , 并探讨其与 G I L uA P —P D、 R表达的关系。 P
1 材 料 与方 法
的表达
蛋 白的提取 按文献 [2 所提供 的方法进行 。 1]
取 6 g蛋 白 的样 本 进 行 S S— A E 电泳 , 后 采 用 O D PG 然 湿 转 法 转 到 P D 膜 上 。用 含 有 5 / V F 0gL奶 粉 的 T S封 B
宋奎 , 晓 军 许 ,陈方 平
‘ 东 省 中 山市人 民 医院 血 液 科 (24 3 ; 中南 大 学湘 雅 医院 血 液科 ( 沙 40 0 ) 广 5 80 ) 长 10 8
【 摘要 】 目的 比较髓性 白血病细胞 K 6 、 L一6 52H 0和 பைடு நூலகம் P一1 附、 H 黏 迁移 能力以及糖基化磷 脂酰肌 醇特 异
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