金刚烷类药物的合成及其抗肿瘤新适应症的研究

金刚烷类药物的合成及其抗肿瘤新适应症的研究
张秋实;李源;宋端正;姜明俊;周云鹏;徐利锋
【摘要】以金刚烷和二甲基金刚烷为原料合成金刚烷胺、金刚乙胺和美金刚胺并对其抗肿瘤新适应症活性进行了测定,其结构经IR和1H-NMR表征.体外实验结果表明,金刚乙胺对胰腺癌和大肠癌体内生物活性较高(IC50与阳性对照药CTX相似),或超过CTX,对乳腺癌MCF7也表现出较好的生物活性.体内活性显示金刚烷胺、金刚乙胺和美金刚胺对肉瘤S180生长都有抑制作用,具有明显抗肿瘤活性.
【期刊名称】《辽宁大学学报（自然科学版）》
【年(卷),期】2018(045)003
【总页数】6页(P249-254)
【关键词】金刚烷胺;金刚乙胺;美金刚胺;抗肿瘤;合成
【作者】张秋实;李源;宋端正;姜明俊;周云鹏;徐利锋
【作者单位】辽宁利锋科技开发有限公司,辽宁沈阳110041;辽宁大学药学院,辽宁沈阳110036;辽宁大学药学院,辽宁沈阳110036;辽宁利锋科技开发有限公司,辽宁沈阳110041;辽宁大学药学院,辽宁沈阳110036;辽宁利锋科技开发有限公司,辽宁沈阳110041
【正文语种】中文
【中图分类】R967
0 引言
金刚烷及其衍生物和类似物大多具有低毒性和良好的脂溶性,并体现出独特的药理
活性,他们在抗病毒药、治疗座疮药、抗帕金森综合症药、治疗肺结核药、抗抑郁
药和抗糖尿病药等，在临床上已应用多年，金刚烷胺盐酸盐是应用于临床最早的抗病毒活性药物,现有的应用于临床的金刚烷药物还有金刚乙胺、多巴金刚、索金刚、曲金刚胺等.通过国内外专利和文献方面系统检索发现，上述药物除了原来的适应
症外，国内外还有大量的研究发现新的适应症及其应用，这些国内外文献报道和专利发明主要集中在抗新型病毒的应用，对神经系统的活性和神经保护作用、呼吸道感染治疗、肺结核治疗、皮肤病治疗等.除此之外，上述药物在抗肿瘤活性的研究
和抗肿瘤新的适应症应用鲜有报道.因此，深入研究金刚烷类药物及其衍生物的抗
肿瘤活性具有重要的现实意义.
本文通过合成金刚烷胺、金刚乙胺和美金刚胺，并考察了对大肠癌HT-29，胰腺
癌Panc-1，肺癌NCI-H460和乳腺癌MCF7等细胞株的抑制活性，此外还进行
了小鼠抗肿瘤活性的测定.
1 仪器与试剂
Spectrum One型红外光谱仪(KBr压片)
ARX-600型核磁共振仪(DMSO-d6为溶剂，TMS为内标)
X-4A型显微熔点仪(温度未矫正)
各种试剂除特殊说明外,均为分析纯，其中金刚烷和二甲基金刚烷：购买于江宁民
利油脂厂，纯度99.9%.
2 实验方法
2.1 金刚烷胺的合成
2.1.1 溴代金刚烷(2)的制备
在100 mL干燥的反应瓶中，取金刚烷(1)10.0 g，按金刚烷∶溴∶亚硫酸氢钠的质
量比为1∶2.2∶0.56，取液溴22.0 g和亚硫酸氢钠5.6 g.将金刚烷研磨碎加入预先干燥好的烧瓶中,搅拌中慢慢滴加溴素，缓慢升温，严格控制温度1 h内从50 ℃升高到70 ℃，之后控制反应为回流状态6 h，最终温度达110 ℃，反应后放置室温过夜.次日，逐渐升温到45 ℃，滴加由亚硫酸氢钠配制成的7%的水溶液，以除去过剩的溴，过滤，滤饼水洗至pH=7，自然干燥，得溴代金刚烷粗产物，重量为13.7克，收率86.6%.
2.1.2 金刚烷胺(3)的制备
在100 mL干燥的反应瓶中，将10 g溴代金刚烷(2)和4.5 g尿素进行混合后研磨碎.加热至原料熔融，后至180 ℃时反应开始，同时有气体产生，温度升高至240 ℃，反应结束后.将金刚烷胺用盐酸加热充分溶解，加入与金刚烷胺质量比为0.05∶1的活性炭脱色用后过滤，滤液用氢氧化钠调节pH至碱性，有固体析出,过滤，干燥，得较纯金刚烷胺6.0 g，收率85.4%.IR(KBr,cm-1) 3 437,3 183,3 033,2 925,2 853,1 599,1 493,1 477,1 453,1 376,1 365,1 312,1 085；1H NMR(CDCl3)δ 8.19(b,2H),2.08(m,4H),1.82(m,3H),1.70(m,4H),1.57(m,4H). 2.2 金刚乙胺的制备
2.2.1 金刚烷甲酸(4)的制备
在500 mL烧瓶中，加入98.4%的浓硫酸200 mL，开动搅拌，在5～10 ℃左右,加入溴代金刚烷(2)10.1 g、正己烷25 mL，快速搅拌下，滴加甲酸22.5 mL，控制1 h滴加完毕，继续保温反应3 h.将反应液倒入750 mL冰水中，搅拌，有白色固体析出，析出完全后，过滤，干燥，固体溶于乙醚，用NaOH 50 mL洗涤3次.再用稀HCl酸化，干燥，得到白色的金刚烷甲酸8.1 g，收率95.8%.
2.2.2 金刚烷甲酰氯(5)的制备
在100 mL三口烧瓶中，加入金刚烷甲酸(4)9.0 g和氯化亚砜18 mL，滴加催化
量的DMF，升温至80 ℃，回流反应3 h，检测原料消失，减压除去过量的氯化亚砜，用甲苯25 mL溶解，溶液直接用于下一步反应.
2.2.3 金刚烷乙酮(6)的制备
在100 mL三口烧瓶中，分别加入无水乙醇1 mL和甲苯11 mL，称取镁粉1.2 g、碘0.6 g，开动搅拌,缓慢升温至80 ℃，开始滴加甲苯15 mL、丙二酸二乙酯12
g和无水乙醇4 mL的混合液，0.5 h滴加完毕，继续回流反应2 h，至溶液澄清后，滴加上述金刚烷甲酰氯(5)的甲苯溶液，回流反应2 h，冷却至室温，倒入
200 mL的冰水中，静置分层，收集上层棕红色溶液，下层用甲苯50 mL萃取2次，合并有机相，用无水硫酸钠干燥，减压蒸除溶剂，残余物为金刚烷甲酰丙二酸二乙酯粗品，然后加入冰醋酸25 mL、水15 mL和浓硫酸2 mL，加热回流至不
再有CO2气体冒出，冷却后，倒入150 mL冰水中，过滤，干燥，得浅黄色金刚烷乙酮6.3 g，两步收率 70%.
2.2.4 金刚烷乙酮肟(7)的制备
在250 mL反应瓶中，加入吡啶80 mL、无水乙醇80 mL，称取盐酸羟胺19 g，加热到100 ℃，溶液澄清后，加入金刚烷乙酮(6)14.2 g，回流2.5 h，减压除去
溶剂后，倒入200 mL水中，有固体析出，过滤，干燥，得金刚烷乙酮(7)的粗品15.7 g，收率97%.
2.2.5 金刚乙胺盐酸盐(8)的制备
在压力釜中，加入金刚烷乙酮(7)9.5 g、冰醋酸200 mL和Pt/C催化剂0.5 g，在室温和0.4 MPa氢气压力下，连续反应24 h，滤去催化剂，滤液减压浓缩，加水100 mL于浓缩液中，再滴加3 mol/L的氢氧化钠溶液调pH 9～10，用二氯甲烷,60 mL萃取3次，萃取液用无水硫酸镁干燥3 h，滤除干燥剂，通入干燥的氯
化氢气体,得金刚乙胺盐酸盐(8)10.2 g，收率95%.IR(KBr,cm-1) 3 438,3 031,2 905,2 851,1 603,1 504,1 450,1 393,1 374,1 341,1 263,1 207,1 190,1 078,984；
1H NMR(DMSO-d6) δ
7.94(b,2H),3.40(m,2H),2.76(m,1H),1.67(m,4H),1.57(m,8H),1.49(m,4H).
2.3 金刚美胺的合成
2.3.1 1-溴-3,5-二甲基金刚烷(10)的制备
在 150 mL 的三口反应瓶中，加入1,3-二甲基金刚烷(9)16.4g(0.1mol)，缓慢加
入液溴24.0g(0.15 mol).开动搅拌，并升温至回流，尾气用稀NaOH水溶液吸收.保温反应 10 h，停止搅拌.减压蒸除多余的液溴，反应液中残余的液溴再用 30%的NaHSO3分解至溶液为无色.然后用氯仿25 mL×3次提取，提取液用无水硫酸钠
干燥，常压蒸出氯仿，得到 1-溴-3,5-二甲基金刚烷的粗品22.3g，产率 91.5%. 2.3.2 1-乙酰胺基-3,5-二甲基金刚烷(11)的制备
在250 mL的反应瓶中，称取1-溴-3,5-二甲基金刚烷18.5g(0.8 mol)和乙腈53.0 g(1.3 mol)，降温至5～10 ℃，开动搅拌，缓慢加入140 mL浓H2SO4，滴加完毕后，室温搅拌反应12 h，得到淡黄色粘稠液体.将反应液慢慢倾倒至碎冰中，快速搅拌下，有白色的沉淀析出.抽滤得固体，用适量水洗至中性，烘干得 1-乙酰胺基-3,5-二甲基金刚胺粗品16.2 g，氯仿重结晶，得白色结晶15.6 g，产率 96%. 2.3.3 美金刚胺(12) 的制备
在 100 mL 的反应瓶中，称取1-乙酰胺基-3,5-二甲基金刚烷(11)11.0g(0.05 mol)、乙二醇10.0 g(0.15 mol)、NaOH 10.0g和水2.6 mL，缓慢升温并搅拌使NaOH 溶解.升温至150 ℃搅拌反应12 h.停止搅拌，反应液冷却至室温后倾倒入碎冰中，快速搅拌，静置1 h，有油状物析出.用石油醚25 mL×3 提取，提取液用无水硫酸钠干燥，减压除去溶剂，得淡黄色的油状液体1-氨基-3,5-二甲基金刚烷8.9g，产率82.3%.IR(KBr,cm-1) 3 419,2 943,2 900,2 861,2 707,2 613,2 055,1 615,1 603,1 513,1 456,1 364,1 357,1 344,1 322；1H NMR(DMSO-d6) δ
8.24(b,2H),2.15(m,1H),1.65(m,2H),1.45(m,4H),1.29(m,4H),1.06(m,2H),0.85(s, 6H).
3 药理学活性测定
3.1 体外抗癌活性测定
1)细胞系选用人乳腺癌细胞系MCF7、人胰腺癌细胞系Panc-1、人肺癌细胞系NCI-H460、人大肠癌细胞系HT-29；其培养基为DMEM(Gibco BRL)，含10%胎牛血清(Gibco BRL)及2 M L-谷氨酰胺(Gibco BRL).
2)测试样品:化合物3、化合物8和化合物12取上述样品溶于二甲基亚砜(美国Sigma公司产品)，用培养基倍比稀释.二甲基亚砜在培养基中的终浓度为0.5%.阳性对照药为环磷酰胺(CTX，纯度>96%，)，用培养基倍比稀释.
3)方法细胞经胰蛋白酶消化后，分散成单个细胞，并使其悬浮在含青霉素(25
μg/mL)和链霉素(25 μg/ mL)的上述培养基中.将细胞接种于96孔培养板(Corning Incorporated)，含5%CO2的空气，相对湿度100%，在37 ℃条件下培养24 h后.
弃去培养液，加入含一系列浓度受试物的培养液，每一浓度设平行孔，培养48 h 后，弃去含受试物的培养液，代之以含噻哗蓝(MTT，美国Sigma公司产品)培养液，MTT终浓度为0.5 μg/mL，继续温育4 h后加酸化异丙醇溶解液，待紫色结晶完全溶解，在SK601型酶标仪(日本国Seikagaku公司产品) 检测570 nm/630 nm的光密度(OD).按下式计算细胞存活率：
(实验组OD/对照组OD)×100%
阳性对照药CTX与受试物同样处理.
体外抗肿瘤细胞结果参见表1.
表1 体外抗癌细胞结果3种化合物IC50(μM) 值IC50大肠癌HT-29胰腺癌Panc-1肺癌NCI-H460乳腺癌MCF7化合物318.8151.325.186.18化合物
83.922.4222.012.73化合物1213.1352.9760.5234.33CTX2.262.234.300.92
受试物抑制肿瘤细胞生长作用结果参见图1.
图1 受试物抑制肿瘤细胞生长作用
4)结果受试物为化合物3，化合物8和化合物12，筛选细胞株为乳腺癌MCF7、大肠癌HT-29、胰腺癌Panc-1、肺癌NCI-H460.以CTX为对照进行试验，试验结果表明，乳腺癌细胞、胰腺癌、与大肠癌对上述化合物敏感性好，其中化合物8对胰腺癌和大肠癌活性较高(IC50 与阳性药物CTX相似)，或超过CTX，对乳腺癌MCF7也表现出了一定的抗肿瘤活性.
3.2 抗肿瘤制剂的制备
分别称取1.0 g化合物3、8和12，加入二甲基亚砜(DMSO)120 mL，搅拌溶解后，加入20 mL吐温80和120 mL 1,2-丙二醇，搅拌混合均匀，加注射用水至总体积1000 mL，用0.22 μm滤膜过滤，分装，120 ℃热压灭菌30 min，检漏，全检，包装，即得10 mg/10 mL(氨瓶)，共100支.
3.3 体内抗肿瘤活性测定
1)材料
测试样品：化合物3、化合物8和化合物12.
试验动物：昆明种实验用鼠，体重18～22g，雌雄各半分组，每组10只，由中国医科大学动物中心提供.
瘤株：小鼠肉瘤S180为腹水型传代，来源于北京军事医学科学院药物研究所. 2)方法
动物模型的制备:无菌条件下吸取7 d生的肉瘤S180传代小鼠腹水，用生理盐水将肿瘤细胞悬液稀释至密度为4×107 cell·m L-1，每只小鼠接种0.2 mL肿瘤细胞悬液于右前肢腋窝皮下，接种7 d后，在造模的小鼠腋下长出大小较为一致的肉瘤，造模即为成功.为保证肉瘤细胞的活力，将肿瘤细胞悬液放于含冰的器皿中，
造模整个过程应4 h内完成.
将接种完24 h的小鼠，随机分组，空白对照组、阳性药环磷酰胺(CTX)对照组
25mg/kg；阳性药5-氟脲嘧啶(5-FU) 对照组15 mg/kg；化合物3组25 mg/kg、化合物8组40 mg/kg、化合物12组12.5 mg/kg.
各组小鼠每日给药1次，连续给药7 d，结束给药次日处死小鼠，剥取瘤块，称量瘤块及小鼠质量，计算体重变化情况及抑瘤率.
抗肿瘤活性结果参见表2.
表2 对肉瘤S180生长的抑制作用组别给药途径体重/g给药前给药后瘤重/g抑瘤率/%P值<Control-23.87±1.7027.05±3.982.41±1.22--
CTXiv22.45±0.7928.22±2.461.04±0.3738.40 0.01∗5-
FUiv21.61±1.5629.16±2.501.64±0.5033 0.05∗化合物
3iv21.41±2.5227.93±3.371.27±0.5031.350.05∗化合物
8iv19.35±0.9526.02±3.691.06±0.51 43.670.01∗化合物
12iv21.31±1.5328.98±1.741.10±0.7742.70.05∗
3)结果:化合物8和化合物12抑瘤率明显好于阳性对照组5-氟尿嘧啶和环磷酰胺.
试验结果表明：化合物8(40 mg/kg)和化合物12(12.5 mg/kg)抑瘤率均超过42%.与空白组比较，当 P<0.05 为有显著性差异，P<0.01为有非显著性差异，因此化合物8和化合物12具有明显抗肿瘤活性.
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