虫草提取物减轻细胞氧化损伤作用

虫草提取物减轻细胞氧化损伤作用

顾宇翔1，李素霞2，庞怀宇2，袁勤生2*

1，上海质量监督技术检验研究院，上海200233，华东理工大学生物工程学院，上海200237；

由于目前人们对化学合成抗氧化药物（如BHT等）的副作用和毒性反应日益担忧，天然抗氧化剂正越来越受到人们偏爱。虫草作为一种名贵的中药、它所特有的药用价值已被普遍证实，但尚没有查阅到虫草减轻细胞氧化损伤方面的报道。本工作以过渡金属离子Fe2+作为自由基产生的来源考察了天然冬虫夏草、蛹虫草及其发酵菌丝体的水和醇提取物减轻细胞氧化损伤的作用。Fe2+既是生物体所必须的过渡金属离子，是体内许多酶的金属辅基，具有重要的生理学作用；但同时它也能催化产生具有细胞毒性的氧自由基并诱导脂质过氧化反应。

1 实验材料

天然冬虫夏草（Cordyceps sinensis）采自四川省，天然蛹虫草（Cordyceps militaris）采于辽宁省沈阳市辉山。人肝癌细胞株SMMC-7721（中国第二军事医学院）；人肺癌细胞株95D（华东理工大学药学院）；

2 方法

2.1 虫草提取物减轻金属离子诱导的95D细胞氧化损伤

2.2 虫草提取物提升胞内SOD和CAT水平

胞内SOD和CAT水平的测定分为两组：（a）不加入0.01 mmol/L H2O2和50 µmol/L Fe2+，只加样品（10-50 μg/ml）的组，此组设有不加样品的空白。（b）加入含0.01 mmol/L H2O2、50 µmol/L Fe2+、样品或茶多酚（10-50 μg/ml）的组，此组设有只加H2O2和Fe2+，不加样品的对照。

超氧化物歧化酶活力测定：联苯三酚自氧化法[179]。

过氧化氢酶活力的测定按照文献[180]：一个酶活力单位（U）定义为在25 ℃，50 mM磷酸缓冲液中（pH 7.0），每分钟分解一个微摩尔过氧化氢所需要酶的量，以U/mg 蛋白质表达。其中过氧化氢在240 nm处的消光系数定为43 mol/（L×cm）。

2.3 其它抗氧化指标的测定

虫草提取物减轻自由基对细胞生长的损伤、抑制金属离子诱导的细胞脂质过氧化和降低胞内ROS水平，并以茶多酚作为抗氧化活性对照品。

3 结果

3.1 虫草提取物减轻活性氧和自由基对细胞生长的抑制

虫草及其制品的提取物能够缓解自由基引起的生长抑制（见图1），并且细胞的量与加入样品的剂量大致成正比。其中以50 µg/ml天然蛹虫草和冬虫夏草的水提取物组的细胞存活率最接近空白组，与抗氧化对照品茶多酚的作用相似。

图1 虫草提取物减轻过氧化氢对95D细胞生长的抑制

CCSW：冬虫夏草菌丝体水提取物；CCSE：冬虫夏草菌丝体醇提取物；CCMW：蛹虫草菌丝体水提取物；CCME：蛹虫草菌丝体醇提取物；NCSW：冬虫夏草水提取物；NCSE：冬虫夏草醇提取物；NCMW：蛹虫草水提取物；NCME：蛹虫草醇提取物。

浅色带：10 μg/ml；灰色带：30 μg/ml；深色带：50 μg/ml。

3.2 虫草提取物对细胞脂质过氧化的抑制作用

加入Fe2+和H2O2的对照组比空白组的TBRAS值有很大的上升，从 1.59 μmol/106个细胞变为4.07 μmol/106个细胞（见图2）。除发酵冬虫夏草菌丝体外，各样品的加入都可以明显降低脂质过氧化值，而且降低的量与加入的剂量基本呈正比。在8种提取物中以天然蛹虫草降低的TBRAS值最多，不但多于茶多酚，更使其TBRAS水平接近于正常状态下的细胞。在10、30和50 μg/ml用量时它的TBRAS值分别为 2.38、1.85及1.41µmol/106个细胞。总体上说，天然虫草提取物抑制脂质过氧化的效果比发酵菌丝体要好，而蛹虫草TBRAS降低的值比相应的冬虫夏草要多。

图2 虫草提取物对95D细胞脂质过氧化的抑制作用

描述同图1。冬虫夏草发酵菌丝体水和醇提取物对TBRAS值没有明显影响（P >0.05），故没有列出。

3.3 虫草降低胞内ROS水平的作用

Fe2+和H2O2诱导的氧化损伤使细胞内ROS的量极大增加，对照组的DCF荧光值是空白组的4倍多。样品清除ROS的能力呈现与剂量成正比的提高，尤其在天然蛹虫草的水和醇提取物中表现的更为明显，而且除此两组以外，其它样品的DCF荧光值都要显著高于相应浓度的茶多酚。蛹虫草提取物清除胞内ROS的能力要强于相应的冬虫夏草，各组样品水提物和醇提物清除胞内ROS能力的差异并不显著。天然虫草提取物的效果要好于相应的发酵菌丝体，其中又以发酵冬虫夏草菌丝体提取物的效果最差，与对照组相比其DCF荧光值仅由369下降到了50 μg/ml 剂量时的322和301。

图3 虫草提取物降低95D细胞胞内ROS水平的作用

有关描述同图2。

3.4 虫草提高胞内SOD和CAT活性的作用

作为胞内重要的抗氧化酶，超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化氢酶（CAT）的活性也是衡量细胞氧化-还原状态的重要标志。数据表明虫草提取物确实对SOD和CAT的活性的提升具有一定促进作用。正常培养条件下各样品对SOD 和CAT活性的影响很小，即使在最大浓度50 μg/ml时也仅有天然虫草的水提取物、发酵蛹虫草菌丝体的醇提取物这三组的SOD和CAT活性有一定上升，和空白组存在显著性差异（P<0.05）。在Fe2+和H2O2诱导的氧化压力之下对照组中SOD和CAT活性降低了不少，而虫草提取物的加入能使其酶活下降幅度减小，但尚不能使细胞回复到正常的状态。天然蛹虫草的水提取物在所有组表现出了最强的提高胞内SOD和CAT活性的作用，与抗氧化对照品茶多酚的效果相差不多。值得注意的是，在之前的一系列实验中抗氧化活性最低的冬虫夏草菌丝体对于促进这两种抗氧化酶活力的上升有着比较明显的作用，在SOD酶活上表现得更为明显。它的效果超过了天然冬虫夏草，接近于天然蛹虫草提取物。

4 讨论

实验选用的自由基诱导物过氧化氢和亚铁离子能在一定的条件下生成羟自由基等活性氧。羟自由基是生物体内最活泼的自由基，它能捕获与氨基酸相连的碳上的氢原子，形成以碳原子为中心的蛋白质自由基并可以和不饱和脂肪酸形成