实验23 琼脂糖凝胶电泳法测定乳酸脱氢酶同工酶 - 副本
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2．0.082mol/L巴比妥-盐酸缓冲液（pH 8.2） 3．10mmol/L乙二胺四乙酸二钠
4．5g/L缓冲琼脂糖凝胶
5．8g/L缓冲琼脂糖凝胶
6．显色试剂
7．固定漂洗液
操作步骤
1．制备琼脂糖凝胶玻片 2．加样 用微量加样器加约40μl血清于槽内。
3．电泳 电压75V～100V，电泳30min～40min。
LD pH8.8 9.8 L 乳 酸 NAD 丙 酮 酸 NADH H
NADH H 2PMS 2PMSH NAD
2PMSH INT 2PMS INT H H
试剂与器材
1．巴比妥缓冲液（pH 8.6，离子强度0.075）
思考题
1．LD同工酶测定时为什么要严禁溶血？为何测定 LD的血清标本不能冰冻或冷藏？
2．LD同工酶测定对疾病诊断的临床意义为何优于 LD总活性测定？
3．LD同工酶琼脂糖电泳测定的原理是什么？在电 泳中应注意哪些事项？
Ax LD（ ） 100 x % (x=1，2，3，4，5 ) A总
参考范围
健康成年人血清中LD同工酶百分比 有下述规律：LD2＞LD1＞LD3＞LD4＞LD5。
临床意义
1. LD同工酶电泳分析在临床上常用于急性心肌梗死的诊断，在
急性心肌梗死时LD1与LD2活性均升高，但LD1升高更早、更
素 4ml，于沸水浴中加温5 min～10min，取出冷却后
以570nm波长比色。
空白管则取大小相同但无同工酶区带的凝胶，用
上述相同的方法处理。
比色后根据各管吸光度计算各同工酶的百分率。
计算
吸光度总和：A总＝A1+A2+A3+A4+A5，
式中A1、A2、A3、A4、A5为各同工酶区带的吸光度
各同工酶百分率(%)为：
明显，导致LD1/LD2比值增大。
临床意义
2. 溶血性疾病、幼红细胞贫血症、肾坏死、以及假性肥大性 肌营养不良、活动性风湿性心肌炎、急性病毒性心肌炎患
者血清LD1和LD2的活性也可增高。
3. 肝炎、急性肝细胞损伤时LD5增高。急性肺损伤、白血病、 胶原病、心包炎以及病毒感染时LD2和LD3增高。 4. 胃癌、结肠癌和胰腺癌患者血清中五种LD同工酶均可升 高，但以LD3增高最为显著。骨骼肌损伤时LD4和LD5增
4．显色
5．固定和漂洗
结果观察
1．目视观察 在碱性介质中，LD同工酶电泳条带 由正极到负极依次为：LD1、LD2、LD3、LD4 和LD5。按各区带呈色的深浅，比较LD各同工酶 区带呈色强度的关系。
2．光密度计扫描 用光密度计在570nm波长下扫 描，求出各同工酶区带吸光度所占百分比。
结果观察
3．在不具备光密度仪扫描条件下，如果需要进行定量， 可将各区带切开，分别装入试管中，加入400 g/L尿
琼脂糖凝胶电泳法测定 乳酸脱氢酶同工酶
苏州大学附属第二医院 检验科 王冰莹
实验目的
掌握：电泳法测定血清乳酸脱氢酶同工酶的基本 原理。 熟悉：电泳法分离血清乳酸脱氢酶同工酶的的操 作过程、注意事项及对疾病诊断的临床意义。 了解：琼脂糖凝胶电泳的临床应用。
实验原理
乳酸脱氢酶同工酶的一级结构和等电点不同， 在一定的电泳条件下，使其在支持介质上分离。然 后利用酶的催化反应进行显色：
wenku.baidu.com高。
注意事项
1．严禁溶血。
2．LD4与LD5（尤其是LD5）对热很敏感，因此底 物-显色液的温度不能超过50℃，否则易使LD5等 变性失活。
3．LD4和LD5对冷不稳定，容易失活，应采用新鲜 标本测定。如果需要，血清应放置于25℃条件下 保存，一般可保存2d～3d。 4．PMS对光敏感，故底物显色液需避光保存，否则 显色后凝胶板背景颜色较深。
4．5g/L缓冲琼脂糖凝胶
5．8g/L缓冲琼脂糖凝胶
6．显色试剂
7．固定漂洗液
操作步骤
1．制备琼脂糖凝胶玻片 2．加样 用微量加样器加约40μl血清于槽内。
3．电泳 电压75V～100V，电泳30min～40min。
LD pH8.8 9.8 L 乳 酸 NAD 丙 酮 酸 NADH H
NADH H 2PMS 2PMSH NAD
2PMSH INT 2PMS INT H H
试剂与器材
1．巴比妥缓冲液（pH 8.6，离子强度0.075）
思考题
1．LD同工酶测定时为什么要严禁溶血？为何测定 LD的血清标本不能冰冻或冷藏？
2．LD同工酶测定对疾病诊断的临床意义为何优于 LD总活性测定？
3．LD同工酶琼脂糖电泳测定的原理是什么？在电 泳中应注意哪些事项？
Ax LD（ ） 100 x % (x=1，2，3，4，5 ) A总
参考范围
健康成年人血清中LD同工酶百分比 有下述规律：LD2＞LD1＞LD3＞LD4＞LD5。
临床意义
1. LD同工酶电泳分析在临床上常用于急性心肌梗死的诊断，在
急性心肌梗死时LD1与LD2活性均升高，但LD1升高更早、更
素 4ml，于沸水浴中加温5 min～10min，取出冷却后
以570nm波长比色。
空白管则取大小相同但无同工酶区带的凝胶，用
上述相同的方法处理。
比色后根据各管吸光度计算各同工酶的百分率。
计算
吸光度总和：A总＝A1+A2+A3+A4+A5，
式中A1、A2、A3、A4、A5为各同工酶区带的吸光度
各同工酶百分率(%)为：
明显，导致LD1/LD2比值增大。
临床意义
2. 溶血性疾病、幼红细胞贫血症、肾坏死、以及假性肥大性 肌营养不良、活动性风湿性心肌炎、急性病毒性心肌炎患
者血清LD1和LD2的活性也可增高。
3. 肝炎、急性肝细胞损伤时LD5增高。急性肺损伤、白血病、 胶原病、心包炎以及病毒感染时LD2和LD3增高。 4. 胃癌、结肠癌和胰腺癌患者血清中五种LD同工酶均可升 高，但以LD3增高最为显著。骨骼肌损伤时LD4和LD5增
4．显色
5．固定和漂洗
结果观察
1．目视观察 在碱性介质中，LD同工酶电泳条带 由正极到负极依次为：LD1、LD2、LD3、LD4 和LD5。按各区带呈色的深浅，比较LD各同工酶 区带呈色强度的关系。
2．光密度计扫描 用光密度计在570nm波长下扫 描，求出各同工酶区带吸光度所占百分比。
结果观察
3．在不具备光密度仪扫描条件下，如果需要进行定量， 可将各区带切开，分别装入试管中，加入400 g/L尿
琼脂糖凝胶电泳法测定 乳酸脱氢酶同工酶
苏州大学附属第二医院 检验科 王冰莹
实验目的
掌握：电泳法测定血清乳酸脱氢酶同工酶的基本 原理。 熟悉：电泳法分离血清乳酸脱氢酶同工酶的的操 作过程、注意事项及对疾病诊断的临床意义。 了解：琼脂糖凝胶电泳的临床应用。
实验原理
乳酸脱氢酶同工酶的一级结构和等电点不同， 在一定的电泳条件下，使其在支持介质上分离。然 后利用酶的催化反应进行显色：
wenku.baidu.com高。
注意事项
1．严禁溶血。
2．LD4与LD5（尤其是LD5）对热很敏感，因此底 物-显色液的温度不能超过50℃，否则易使LD5等 变性失活。
3．LD4和LD5对冷不稳定，容易失活，应采用新鲜 标本测定。如果需要，血清应放置于25℃条件下 保存，一般可保存2d～3d。 4．PMS对光敏感，故底物显色液需避光保存，否则 显色后凝胶板背景颜色较深。