中国人RH部分D表型的分子机理研究

作者：吴俊杰，洪小珍，许先国，何吉，傅启华，严力行
【摘要】为了研究部分d表型的分子机理，用间接抗人球蛋白方法 (iat)筛选弱表达的d变异体，pcr-ssp（polymerase chain reaction-sequence sepecific primer）方法扩增rhd基因特异的外显子及其侧翼序列，用pcr产物直接序列分析测定核苷酸的变异。

结果表明：从22例弱d中检测到10例部分d表型，其中d va（kou.）、d va（hus.）和d va-like （yh.）各1例，d vi type ⅲ表型7例。

结论：10例部分d表型的分子机理得到明确，其中d va（kou.）、d va-like （yh.）表型为国内首次报道。

【关键词】 rh血型
molecular basis of partial d phenotypes in chinese
rh血型系统是目前已知的29个人类红细胞血型系统中最复杂的一个［1］。

rh血型的核心抗原包括rhd和rhce（主要有ce、ce、ce、ce 4种组合）蛋白，它们分别由1条417个氨基酸组成的肽链所编码。

疏水性分析表明，它们都包括6个胞外环、12个跨膜区域和7个胞内环。

rhd和rhce多肽链仅有30-35个氨基酸的差异。

d 抗原因为具有较强的免疫原性在临床上有重要的意义。

对d抗原表位的分类已经从最初的7个细分到37个［1］。

通过鉴定这些表位，可以明确部分d的具体表型。

但是，目前针对这些表位的一系列单克隆抗体谱散布于国外一些大型的输血医学研究机构和血型参比实验室中，只有通过国外会议交流或者私人赠送的途径才能获得。

因此，单克隆抗体的匮乏影响了部分d表型的血清学鉴定。

另外一个有效的途径是从基因水平去研究d变异体的分子机理，明确其变异位点，从而鉴定部分d。

目前，d变异体的分子机理研究已经有很多报道，但是对部分d表型的分子机理研究主要集中在白人、非裔黑人和日本人中，在中国人群中的相关研究报道很少［1］。

我们从弱d 中通过分子水平的研究鉴定了10例部分d表型，报道如下。

材料和方法
研究对象
以工作或者生活在浙江省的无偿献血员为研究对象。

在2002-2004的3年研究期间，共收集到rh阴性样本1 272例。

根据抗d试剂说明，对rh阴性血型做进一步的iat实验确认，筛查得到22例弱d样本。

对弱d样本做rhd基因序列分析，发现其中10例为部分d表型，12例为弱d表型。

本研究以10例部分d表型为研究对象。

rh表型血清学鉴定
rhd表型鉴定采用常规盐水平板法或试管法，使用加拿大dominion公司的navaclonetm 混合单克隆抗d试剂（人单克隆igm抗d，d175-2细胞株；人单克隆igg抗d，d415 1e4细胞株）。

根据试剂说明，盐水实验rh阴性的rh血型用iat方法进一步确认。

如果iat实验阳性，并且直接抗人球蛋白实验阴性，则鉴定为弱d表型或者部分d表型；如果iat实验阴性，则鉴定为rh阴性。

抗人球蛋白试剂用美国immuco公司的兔源抗igg。

rhc、rhc、rhe和rhe 鉴定采用盐水试管法，试剂为加拿大titus公司的单克隆抗体。

基因组dna提取
采用puregene dna 纯化试剂盒 (gentra，minneapolis，usa)，从枸橼酸钠抗凝的外周血中制备基因组dna，严格按试剂说明书操作。

d杂合性检测和单倍体型推测
根据perco等的方法［2］，用特异性引物u1-s和rnb31 pcr检测rhesus hybrid box。

如果可以扩增得到2 778 bp的特异性片段，表明存在rhesus hybrid box，有rhd基因的缺失；反之，则不存在rhesus hybrid box，没有rhd基因的缺失。

最大可能的单倍体型根据rhce基因的c/c和e/e等位基因和rhd基因是顺式共遗传，并且rhd基因缺失的单倍体型按cde推算。

pcr-ssp
pcr产物直接测序
pcr扩增产物用pcr产物纯化试剂盒 (qiagen gmbh，德国)纯化后，直接用于序列分析反应。

序列分析反应采用“bigdyetm terminator cycle sequencing kit”试剂盒，dna聚合酶采用amplitaq dna polymerase（applied biosystems公司，美国），最后用abi 377 测序仪 (applied biosystems公司，美国)作序列分析。

结果
d杂合性检测
10例部分d都可以扩增得到2 778 bp的特异性片段，表明存在rhesus hybrid box，有rhd基因的缺失。

10例部分d的分子鉴定
通过对rhd基因特异的外显子及两翼序列的扩增和序列分析，我们共检测到4类部分d 的等位基因（表2）。

table 2. molecular basis of ten partial d phenotypes in chinese （略）
第1类等位基因有外显子5的667 t&g和697 g&c突变（图1），引起rhd蛋白第7个跨膜区域的223 phe&val和第4胞外环的233 glu&gln氨基酸的突变。

根据文献报道，这是d va （kou.）表型［5］。

只1例，可能的单倍体型为cdvae/cde。

第2类等位基因携带外显子5的667 t&g，676 g&c，697 g&c，712 g&a，733 g&c，744 c&t，787 g&a，和 800 a&t，共8个突变（图1），引起编码的rhd蛋白7个氨基酸突变（744c&t 为无义突变）：223 phe&val、226 ala&pro、233 glu&gln、238 val&met、245 val&leu、263 gly&arg和267 lys&met，其中226 ala&pro、233 glu&gln、238 val&met突变位于rhd蛋白的第4胞外环，223 phe&val和245 val&leu突变位于跨膜区域，263 gly&arg和267 lys&met 突变位于胞内环。

推测是rhd基因的整个外显子5通过rhd和rhce基因的基因转换被rhce 基因外显子5替换所致，根据文献报道，这是d va（hus.）表型［5］。

只1例，可能的单倍体型为cdvae/cde。

第3类等位基因携带外显子5的667 t&g，676 g&c，697 g&c，712 g&a，733 g&c，和744 c&t，共 6个核苷酸突变（图1），产生223 phe&val、226 ala&pro、233 glu&gln、238 val&met 和245 val&leu，共5个氨基酸突变（744c&t为无义突变）。

其中226 ala&pro、233 glu&gln、238val&met突变位于rhd蛋白的第4胞外环，223 phe&val和245 val&leu突变位于跨膜区域。

推测也是由rhd/rhce基因外显子5的基因转换所致。

根据文献报道［6］，这是d va-like （yh.）表型。

只1例，可能的单倍体型为cdvae/cde。

讨论
决定d抗原特异性的氨基酸主要位于外显子4、外显子5和外显子7编码的d蛋白的第3、第4和第6胞外环［8］。

这些胞外环氨基酸的单个或者多个错义突变以及rhd基因和rhce 基因外显子3-7之间的基因转换使得d蛋白特异的胞外环的氨基酸被ce蛋白的对应部分取代是构成部分d表型的两个主要分子机理。

因为缺失d抗原特异的氨基酸所编码的d表位，部分d的血清学特征为表达不完整的d抗原，如果受到d阳性细胞（或者携带自身所缺失的表位的d细胞）刺激，会产生针对缺失表位的抗体。

准确鉴定部分d表型对于指导临床输血和育龄妇女采取恰当的预防新生儿溶血病措施等有重要的意义［1］。

本研究运用rhd基因测序方法，从弱d样本中鉴定了10例部分d，其中d va（kou.）、d va （hus.）和d va-like （yh.）各1例，d vi type ⅲ表型7例。

d va（kou.）和d va-like （yh.）表型为国内首次报道。

d杂合性分析发现，10例部分d表型均有rhd基因的缺失，即各部分d等位基因均为半合子。

这和国外报道的弱d和部分d表型先证者的d杂合性结果一致［8］。