抗体技术研究进展(+1+)++人源抗体技术

第33卷第5期暨南大学学报（自然科学版）

Vol．33No．52012年10月

Journal of Jinan University （Natural Science ）

Oct．2012

［收稿日期］2012－03－26

［基金项目］国家自然科学基金项目（81202449）；广东省科技计划项目（201213010300016）［作者简介］向军俭（1952－），男，教授，研究方向：抗体技术与应用

抗体技术研究进展（1）：人源抗体技术

向军俭，童吉宇，王

宏

（广东省分子免疫与抗体工程重点实验室；暨南大学抗体工程研究中心，广东广州510632）

［摘

要］100年来，抗体的发现为人类疾病诊断、治疗和有害物质的分析检测发挥了巨大的作用．特别是1975年

发明了单克隆抗体技术以及1986年发明基因工程抗体技术，为研制特异性高、大量均一并大量生产抗体成为了现实，也使嵌合抗体、全人源抗体造福人类并产生巨大的经济效益．为了克服鼠源性单抗可诱发人抗鼠抗体（HA-MA ），通过嵌合抗体、改构抗体、小分子抗体等技术和改良抗体与抗原结合的特异性，已成为抗体技术研究的主要发展方向，本文主要就抗体人源化及抗体分子小型化，抗体功能复合化两个部分的进展进行综述．［关键词］抗体；

人源化抗体；

基因工程抗体；

抗体库技术；

小分子抗体

［中图分类号］R392．11

［文献标志码］A

［文章编号］1000－9965（2012）05－0524－07

Recent advances in antibody technique （1）：Humanized antibody technique

XIANG Jun-jian ，TONG Ji-yu ，WANG Hong

（Guangdong province Key laboratory of Molecule Immunology and Antibody Engineering ，Jinan University ，Guangzhou 510632，China ）

［Abstract ］In the past 100years ，antibody has played a significant role in human disease diagnosis

and treatment and the analysis of detrimental substances．Especially ，the inventions of both monoclonal antibody technique in 1975and genetic engineering technique in 1986，on one hand ，have made it possi-ble for producing abundant antibodies of high specificity and homogeneity ，on the other hand ，help chim-eric antibody and fully human antibody bring benefit to human beings．To overcome the problem that mu-rine monoclonal antibody may induce HAMA ，technologies such as chimeric antibody ，reshaping antibod-y ，small-molecule antibody and improvements of the specificity between antibody and antigen have be-come the main trend when developing antibody technique．This review gives an overview on antibody hu-manization ，small-molecule antibody and composite function of antibody．［Key words ］antibody ；humanization antibody ；genetic engineering antibody ；

antibody library

technique ；small-molecule antibody 19世纪末抗体首次被发现，其后很长一段时间内人们都以抗原免疫动物获得抗血清（多克隆抗

体）．1975年，

K hler 和Milstein 建立了B 淋巴细胞杂交瘤技术，为大量生产均一、特异性强的单克隆抗体提供了技术支持并使免疫学发生一场革命，有力

地促进诊断与治疗性抗体的发展．然而由于单克隆

抗体大部分为鼠源性抗体，在临床治疗中可在人体

内可诱发人抗鼠抗体（HAMA ）［1］

，限制了单克隆抗体在临床治疗中的应用．随着基因工程技术的发展和对各类抗体结构和氨基酸序列、及其变异种属和

功能之间关系的深入研究，基因工程技术将抗体的表达同抗体DNA重组技术有机的结合起来，基因工程抗体是继血清多克隆抗体、单克隆抗体之后的第三代抗体．

1鼠单抗人源化

为了降低鼠单抗的异源性，人们利用基因工程技术对鼠源单抗进行改造，即鼠单抗的人源化，其基本的方法是保留鼠源单抗与抗原特异结合的部分基因，其余部分用人源抗体基因代替．

1．1人－鼠嵌合抗体

通过对抗原抗体结合作用的分析，发现抗体的可变区是与抗原结的部位，而恒定区与抗原的结合无关，因此可以用人的恒定区基因取代鼠的恒定区基因，构建人－鼠嵌合的质粒载体，通过转染宿主细胞，表达人－鼠嵌合抗体［2］．与鼠单抗相比，嵌合抗体的异源性大大降低，而其结合抗原的特异性和亲和力得到了保留．目前已经有部分嵌合抗体批准应用于临床治疗，如Reopro、Rituxan分别于1994年和1997年批准上市，前者用于治疗心血管疾病，后者用于非何杰奇金斯淋巴癌和类风湿性关节炎的治疗．

1．2人改型抗体

虽然嵌合抗体的异源性相比鼠源单抗有很大程度的降低，但其仍然含有30%左右的鼠源序列，可引起不同程度的HAMA，所以有必要设法进一步降低其鼠源性．进一步研究表明，抗体分子与抗原直接接触的是可变区中的6个互补决定区（complement-determining regions，CDRs）形成的平面，骨（框）架区（framework regions，FRs）作为支架，立体构象保守．因此，将鼠单抗的互补决定区移植到人单抗的骨架区上，使抗体既获得鼠单抗的特异性，又大大的降低鼠单抗的异源性［3］．但是研究表明，起脚手架作用的骨架区不仅提供了CDR的空间构象环境，有时还参加抗体结合位点正确构象的形成，甚至参加与抗原的结合，简单的CDR移植往往导致抗体亲和力的降低或丧失．因此，如何在FR中、FR和CDR 之间进行操作至关重要，目前主要有以下4种策略．（1）模板替换使用与鼠对应部分有较大同源性的人FR替换鼠FR．这种同源替换主要考虑的是，使鼠CDR在替换后有类似的折叠环境，从而保持原来的构象．在选择人FR时通常有两条途径．第一种是对需要进行人源化的鼠单抗，用已有晶体结构数据的人源抗体FR作为替换的基本模板，借助序列比较与分子建模，从而确定在鼠FR中与CDR有密切作用的氨基酸残基，使其保留在替换的人源FR中．此方法中，确切的人源FR晶体结构为残基替换提供了明确的信息，减少了盲目性，但由于改变的氨基酸残基数较多，不易保存CDR的天然构象，成功率低．

第二种是通过对已有的抗体序列库进行筛选，得到与鼠单抗FR有最大同源的人源FR用以替换，此方法同样需要分子建模来提供与CDR移植相关的关键残基信息．此方法所需更改的氨基酸数目较少，能更好的保持CDR折叠所需空间环境．两种方法均有成功的实验报道．两种方法均需要通过分子模建来提供CDR移植后可能或缺的FR关键残基的信息．同源替换的优点在于减少需要更改的氨基酸数目，更好地保持CDR需要的空间环境；不足在于选择的人源FR可能并无结构数据，不能提供有效的关键残基信息．

（2）表面重塑抗体对鼠CDR及FR表面残基进行修饰或重塑，使之类似于人抗体CDR的轮廓或人FR的型式．

1991年Padlan经过研究发现尽管鼠和人的可变区来自不同种属，但暴露于表面的氨基酸残基的位置和数目却非常保守，它们是可变区免疫原性的主要来源，于是Padlan提出了利用表面重塑的方法来改造非人源抗体［4，5］，此方法的原则是将鼠可变区中暴露在表面的骨架区残基替换为人源性残基．此方法可以不进行同源建模，在序列同源分析的基础上，选择与鼠表面残基暴露类型最匹配的人源型式进行，但是不够准确，且如果改变后的残基在侧链大小、电荷、疏水性方面变化较大或者形成氢键，从而影响到CDR的构象，则此残基不予改变，以减少CDR-FR之间的不相容性．由于鼠源单抗在人体引起的HAMA反应，究竟是完全由其表面暴露残基引起，还是由内外部残基共同作用，涉及抗体产生的最基本的免疫学机制，而这种机制仍在探讨之中．表面重塑抗体消除异源性的效果如何，至今尚无临床报道．

（3）补偿变换在人FR中，通过对与CDR有相互作用、与抗体亲和力密切相关或与FR空间折叠起关键作用的残基的改变，来补偿完全的CDR移植［6］．

通过对抗体立体结构数据和同源性分析，根据FR残基对抗原结合、CDR构象的稳定、FR的折叠中的重要程度，可将这些残基分为：低风险性残基，

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第5期向军俭，等：抗体技术研究进展（1）：人源抗体技术

高风险性残基和中度风险性残基．低风险性残基暴露于溶剂中，但对抗原结合和抗体结构影响很少，对此类残基进行同源替代既能降低免疫原性又不影响抗体的亲和力；高风险性残基直接参与抗原结合、CDR构象的稳定或FR折叠，此类残基应尽量避免替换．对中度风险性残基的替换应谨慎．通常将FR 中的高风险性残基与部分中度风险性残基通称为非CDR区补充调控残基．由于其可分布于线性序列的不同位置，为不同CDR回折提供合适的“平台”，从而其形状和侧链大小协同决定CDR的基本构象，影响抗原结合特异性．因而在CDR移植时，必须将FR 的这些关键位置也替换为鼠源非CDR区补充调控残基以补偿完全的CDR移植．此方法避免了人源化突变方案盲目性而可能导致失败的探索．并且在对中度风险性残基进行变化时，还有可能提高人源化抗体的亲和力．不足的是对残基的分类要以晶体数据和三维结构为基础，才能提供准确的标准．

（4）定位保留在人源化单抗中，通过保留鼠源单抗中参与抗原结合的CDR和FR中的一些关键残基［7］，其余残基进行人源化，从而保证人源化抗体的抗原结合能力和降低抗原性，但是所得到的人源化抗体序列与人抗体的保守序列在一些位置仍有差别，这些差别来源于在抗体亲和力成熟过程中产生的非典型残基．

通过以人FR保守序列为模板进行人源化是一个有效的途径．首先从现有的人源抗体保守序列中搜寻与鼠框架区最类似的序列；其次根据最简位置模板确定鼠可变区的关键位置残基；最后保留所有这些位置而将其余部分进行人源化．Couto等［8］利用此技术对抗乳腺表皮抗原BA46的抗体Mc3成功地进行了人源化．

1．3抗体库技术人源化抗体

（1）抗体库技术优化人改型抗体在进行抗体人源化过程中，除移植CDR外，还需移植部分在抗原结合过程中起重要作用的骨架区的残基．所以在通过CDR移植构建人改型抗体时，最关键的步骤是确定可影响抗原抗体结合活性的骨架区残基，尽管通过立体构象分析和分子模建有助于这些骨架区残基的确定，但其最终的确定往往需要构建多种抗体的突变体，反复测试．

由于抗体库技术对多样化抗体的强大筛选能力，其可以作为筛选关键骨架区残基的理想方法．通过分析抗体分子结构［9］，找出对抗原结合部位立体构象可能有影响的骨架区残基，将这些残基的鼠源副本和人源副本同时组合到一个抗体库中，进一步筛选过，从而确定需要保留鼠源性的骨架区残基位点［10］．Baca等［11］通过对抗VEGF鼠嵌合抗体的骨架结构的进一步分析，确定了骨架区中可能在抗原结合过程中起重要作的13个残基，将这13个残基进行随机化后构建噬菌体抗体库，通过8轮筛选获得了亲和力提高125倍的人源化抗体．

（2）抗原表位定向选择1994年由Jespers等首先提出，是在噬菌体抗体库技术基础上，对鼠单抗进行人源化的新策略．

此方法利用抗体库技术，通过抗原的诱导筛选，获得能够模拟鼠单抗的可变区，从而结合相同抗原表位的人源抗体［12］．其基本原理：首先选择鼠单抗的一个可变区基因（重链或者轻链）与人抗体的另一个可变区基因（轻链或者重链）配对，构建人－鼠杂合抗体库，通过相应的抗原，筛选出能结合抗原的克隆，从而可得到能与鼠可变区配对的人重或轻链可变区基因，再将所得到的人重或轻链可变区基因与另一条人轻或重链可变区基因文库组合构建成人抗体库，通过相同的抗原筛选，得到可以与抗原特异性结合的人抗体的重轻链基因，获得完全人源化的抗体．

此方法具有操作简便、可获得完全人源化抗体的优点，但是由于人抗体库多样性不一定能满足要求，可能会发生筛选失败，并且经此过程得到的抗体的亲和力得不到保证，甚至有些抗体的特异性会发生漂变．为了克服以上缺陷，可以事先在人可变区抗体库中植入鼠单抗的CDR3，此法一方面不影响抗体的人源性，另一方面可以大大增加抗体与抗原结合的能力．在抗原定向选择方法中，Rader等［13］以亲本鼠单抗的CDR3区基因替换所用的人抗体库中的CDR3，构建了含亲本鼠单抗CDR3基因的人源化噬菌体抗体库，再通过与鼠单抗亲本抗体配对，依次进行链替换，筛选到与亲本鼠单抗识别同一抗原表位的抗人整合素αβγ3人源抗体．

2抗体库技术

抗体库技术的出现，使抗体工程技术进入了一个新的时代．PCR技术的建立、功能性抗体分子片段在大肠杆菌中的成功表达和噬菌体展示技术的发展成为了抗体库技术得以建立的基础．

2．1噬菌体抗体库技术

噬菌体抗体库技术［14］的原理：将编码抗体分子可变区的全套基因克隆出来，与噬菌体外壳蛋白基

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因进行融合，使抗体分子片段表达于噬菌体表面，由于可变区的多样性便导致了噬菌体抗体的多样性，再经过“吸附—洗脱—扩增”，可以有效的筛选出特异性的目的抗体可变区基因．

在建立噬菌体抗体库时，表达载体的选择尤为重要，目前常用于表达噬菌体抗体的主要有丝状噬菌体［15］和噬粒［16］（phagemid）．前者主要通过将抗体片段基因重组于噬菌体外壳蛋白基因Ⅲ5'端前导序列下游，形成融合蛋白，将此噬菌体感染大肠杆菌后，可产生氨基端具有抗体分子片段的外壳蛋白颗粒．

噬粒为质粒载体，含有丝状噬菌体的基因间隔区（约500个碱基对）而不含任何噬菌体编码基因，其作用是介导噬菌体DNA的复制、包装和释放．辅助病毒（helper phage）含有编码所有噬菌体蛋白的基因，当辅助病毒感染了含有噬粒的大肠杆菌时，可将噬粒DNA以单链形式包裹在噬菌体蛋白内，组装成病毒颗粒而释放出大肠杆菌，由于间隔区没有编码基因，所以此病毒颗粒虽然能感染大肠杆菌但是却不能产生子代噬菌体［17］．当用基因工程方法将抗体分子片段基因与噬菌体外壳蛋白基因Ⅲ融合后插入噬粒基因中，再通过辅助病毒感染大肠杆菌，可以得到外壳蛋白上表达抗体分子片段的噬菌体颗粒．在用丝状噬菌体基因作为载体时，为保证融合后噬菌体外壳蛋白的结构不发生很大变化，融合的抗体片段不应超过10个肽，并且由于表达的所有子代噬菌体外壳蛋白都带有抗体分子片段，所以在噬菌体表面抗体分子通常以多价的形式存在，从而不利于筛选高亲和力的噬菌体抗体．而利用噬粒作为载体时，子代噬菌体表面既含有辅助病毒基因编码的外壳蛋白，也含有噬粒基因编码的抗体分子片段—外壳蛋白，两者的数目取决于辅助病毒基因与噬粒基因的相对数量［18］，产生的抗体分子片段大多以单价的形式存在，可用于筛选高亲和力的噬菌体抗体．

目前已经建立了多种噬菌体展示系统［19］：M13噬菌体展示系统，主要展示在5个衣壳蛋白上，即P3、P6、P7、P8和P9蛋白；λ噬菌体展示系统，主要采用D蛋白和V蛋白介导展示；T4噬菌体展示系统，主要展示在HOC和SOC两种衣壳表面附属蛋白上；T7噬菌体展示系统，主要由10B蛋白介导展示．在噬菌体展示技术的应用过程中，根据不同目标选择不同的噬菌体和锚定蛋白，以及展示在锚定蛋白的N端还是C端成为噬菌体展示技术应用的首要考虑问题．随着噬菌体展示系统的开发、改良和新融合策略的应用，噬菌体展示技术在研究蛋白质相互作用、抗体工程和酶特异性等方面发挥着不可替代的作用．邓宁等［20］利用噬菌体展示技术从人外周血淋巴细胞获得抗HBsAg Fab抗体的轻、重链基因．将Fab的轻、重链基因分别整合到巴斯德毕赤酵母（Pichiapastoris）GS115菌株的染色体上，成功构建了高效分泌表达抗HBsAg Fab抗体的酵母工程菌．

2．2核糖体展示技术

同噬菌体展示技术类似，核糖体展示技术［21］建立在DNA文库的基础之上．其基本原理是：首先利用PCR技术构建抗体的DNA文库（此文库无3'末端的终止密码子），再将此文库进行体外表达．由于缺少3'端终止密码子，在翻译到mRNA末端时，mR-NA不会从核糖体上脱落下来，从而形成“抗体蛋白－核糖体－mRNA”三元复合物（protein-ribosome-mRNA complexes，PRM），使抗体展示于核糖体表面．通过抗原的亲和筛选得到可以与抗原有高亲和力的mRNA，通过RT-PCR扩增，PCR产物又可以进入下一轮循环，进行进一步筛选，从而最终获得高亲和力的抗体及其基因序列．

核糖体展示技术主要的优点有：库容大（可达1015），库的构建快（一般1 2d可完成）；筛选不依赖宿主细胞活性；可对毒素、半抗原等体内展示技术无法进行的物质进行筛选；可在每轮RT-PCR中引入突变，促进抗体亲和力成熟［22］．

此技术中，提高PRM复合物的稳定性［23］，保证mRNA的完整性是整个实验成败的关键，在低温、高浓度的Mg2+以及RNase活性抑制剂的条件下，PRM复合物稳定性大大提高．与此同时，对表达系统的选择目前仍没有定论，原核与真核表达系统各有优缺点，前者表达效率高但存在翻译暂停、不正确折叠等问题；后者则表达效率低．利用核糖体技术构建抗体库，通常是从动物或人的外周血淋巴细胞或脾脏中提取总RNA，然后利用设计好的引物，通过RT-PCR与重叠延伸等技术进行构建．由于完整抗体的分子量大，不利于展示，通常以构建scFv库多见．1997年，Hanes与Plückthun［24］利用E．coli S30裂解液系统构建了库容为1013的抗血凝素scFv 库，经5轮筛选后使高亲和力的抗血凝素scFv富集了108倍．

核糖体展示技术诞生的初期主要用于从肽库中筛选高亲和力的配体，随后应用于高亲和力单链抗

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第5期向军俭，等：抗体技术研究进展（1）：人源抗体技术

体（scFv）的筛选，也有学者将此技术应用于酶的活性分析和筛选高活性的蛋白酶［23］中，从而开拓了蛋白酶研究的新思路．

3基因工程小鼠制备全人抗体

3．1转基因小鼠

转基因动物是指将外源基因导入早期胚胎细胞，使之整合于细胞基因组而建立的动物品系．转基因小鼠制备的基本原理［25］是将人的Ig基因导入小鼠的ES细胞（embryonic stem cell，胚胎干细胞）中，然后将此ES细胞再次植入假性受孕雌鼠子宫中，使其发育成带有外源基因的转基因小鼠．转基因小鼠的Ig基因被人相应的基因所取代，从而产生全人的抗体．此技术保留了完整的Ig类别转换和亲和力成熟的自然机理，避免了抗体库中模仿抗体分子重构和亲和力成熟过程的基因水平的复杂性．此技术关键在于构建处于胚系构型（germline configuration）的人Ig基因，主要有3种方法：Ig基因小位点法（miniloci）、P1噬菌体（温和噬菌体）载体法及酵母人工染色体（YACs）法．小位点法是指将Ig基因片段人工地缀合在一起，一般构建的片段较小；P1噬菌体法是应用PI噬菌体为载体，可承载稍大的DNA 片段，并可有效防止其断裂，但构建的基因较人Ig 基因仍偏小；而YACs技术可弥补上述不足，承载更大的DNA片段，从而其抗体谱（antibody repertoire）也更完全，具较大的应用优势．

1997年Mendez等应用YACs等一系列技术分别将1020kb人重链（IgH）链基因组和800kb的人κ轻链（Igκ）基因组导入Ig基因组失活小鼠，获得了名为Xenomouse的小鼠模型．随后经过3种抗原（IL－8、TNF－α、EGFR）免疫后制备的Ig G2κ单抗，都显示了高亲和力，证实转入的人Ig基因组已成功在小鼠B细胞内发生了高频突变和类别转换，标志着基因工程人抗体研制已进入基因组时代．转人Ig基因组小鼠的构建较为复杂，需多次应用转基因技术和胚胎操作技术，基因打靶是转基因技术的核心．以Xenomouse的构建为例：①先行基因打靶分别敲除小鼠重链（IgH）、κ轻链（Igκ）基因，制备IgH、κ失活小鼠（double inaetivited，Dl），然后将其子代多次交配，筛选出IgH、Igκ双失活但保留所有调控Ig基因重排和表达的反式作用序列的小鼠；

②YACs的构建；③构建完成的酵母人工染色体，通过原生质体融合的方法导入小鼠ES细胞．经筛选后可得到分别含有重链和轻链酵母人工染色体的ES细胞；④转人Ig基因组小鼠的获得．将上述筛选的ES细胞显微注射于小鼠囊胚，经体外培养后植入假孕母鼠子宫．随后对受精卵发育成的子代分析鉴定，筛选出分别携带有人IgH和Igκ的小鼠，再与Ig基因失活的小鼠交配，得到遗传背景分别为yH2，DI与yκ2，DI的子代小鼠．由该两系小鼠经互交后产生的遗传背景为yH2，yκ2，DI的小鼠即为人Ig基因组小鼠．

据资料显示，Xenomouse模型小鼠的免疫器官都有大量的hμ+B细胞，研究证明这类hμ+B细胞无论在数量、κ与λ链的比例和成熟标志表达，以及细胞活性功能等方面指标均与野生型小鼠相近，这表明这系小鼠在应用中几乎可以完全取代野生型小鼠．

3．2SCID鼠模型

SCID鼠［26］，全称为联合免疫缺陷鼠（severe combined immunodeficiency mice）．其位于16号染色体发生隐性基因突变，使小鼠的T、B淋巴细胞不能成功分化为功能性淋巴细胞，从而形成联合免疫缺陷．由于缺乏体液和细胞免疫，该突变系小鼠对异源性移植排斥作用很小，可接受人器官和组织的移植，形成人鼠嵌合体，即hu-SCID小鼠．

自1983年SCID小鼠问世以来，已陆续在移植有人外周血淋巴细胞的SCID小鼠中（hu-PBL-SCID）产生了抗破伤风类毒素（T-T）、抗乙肝核心抗原（HBcAg）、抗血吸虫、抗呼吸道合胞病毒等抗体，显示了SCID小鼠在制备人单抗中的一定潜力．从已获得的实验资料看，多数作者报道只有继发免疫才能在hu-PBL-SCID小鼠中获得特异性免疫反应．其原因可能是在hu-PBL-SCID继发性抗体反应比原发性抗体反应易于获得，此现象反映了人记忆性B细胞和原始B细胞的不同的移植和反应特性．可以通过选择合适的供者，或者利用体外致敏等技术使人的淋巴细胞在移入SCID小鼠体内之前进行抗原免疫，在移入小鼠体内之后用同样的抗原再次刺激，获得特异性的抗体．

由于人淋巴细胞在小鼠体内的存活和增殖受到其微环境的调节，故可以从经抗原免疫的hu-PBL-SCID小鼠分离出抗原特异性的人B细胞，进一步融合或者制备抗体库，从而获得针对特异性抗原的全人单抗．目前也有学者将分离的B细胞进行EBV转化［27］，筛选出能分泌特异性抗体的细胞群，进行建系，产生了高特异性的单抗．利用SCID小鼠，结合体外致敏、融合或基因工程技术，可以有效的解决免疫受限，特异性B细胞富集等问题，为获得亲和力高的抗体库提供了新的思路．

825暨南大学学报（自然科学版）第33卷

4单个B细胞抗体技术

相比于噬菌体展示技术和核糖体展示技术，利用SCID小鼠制备单抗的最大优势在于其获得的单抗是保留有完整天然的人抗体的VH和VL链．但由于EBV不可能转化所有的B细胞，被转化的仅仅是其中的一小部分，而融合技术的效率又比较低［28］，所以此方法不适合做大规模的抗体库筛选．为了维持抗体在人B细胞中的天然结构，人们建立了一种基于单个B细胞抗体VH和VL基因扩增和表达的技术．

4．1鉴定和分离单个抗原特异的B细胞

从外周血中收集淋巴细胞，进行B细胞筛选．根据不同的研究目的，单个B细胞的分离可以分别通过“随机分选”或者“抗原特异性分选”两种途径进行［29］．“随机选择”的主要方法有：基于显微操作的细胞分选［30］、激光捕获显微切割技术以及流式细胞分选技术．“抗原特异性分选”的主要方法有：抗原包被的磁珠分离、荧光包被的抗原多参数流式细胞分选［31］、溶血空斑实验和荧光灶实验等．为了满足高效、高通量筛选分泌单抗细胞的需求，人们又建立了细胞微阵列芯片系统，主要包括显微雕刻技术［32，33］和免疫斑点阵列芯片技术［34］．

显微雕刻技术利用凹雕和软板印刷技术来构建含有单个细胞分泌物的微阵列．芯片的制作选用聚二甲基硅氧烷（PDMS）为材料，大小与“1?3”的盖玻片相匹配，其阵列的微孔直径和深度均为50或100μm，微孔间隔与微孔直径相同．通过将细胞稀释，静置培养，使B细胞粘附在微孔上，用细胞分裂素刺激B细胞分化为能产生抗体的浆细胞，产生的抗体在相应的盖玻片上印制出对应的蛋白质阵列，然后用荧光标记的抗原对抗体微阵列进行扫描筛选，其结果与相应的细胞阵列成对应关系，通过显微操作技术挑出目标孔中的细胞，进行后续的克隆扩增或者单细胞的RT-PCR［33］．这样在每次可对近十万个多克隆B细胞进行筛选．

4．2单个B细胞的免疫球蛋白基因的转录扩增，测序和克隆

从单个B细胞获得cDNA为同步研究IgH和IgL基因的表达提供了很好的方法，通常不同类型的B细胞的特异性Ig基因转录量上有明显的不同，例如，相对于记忆B细胞来说，浆细胞的Ig基因表达量要大很多，所以浆细胞有利于特异性的Ig基因的扩增．通常，基因的扩增通过巢式RT-PCT［35］（nested RT-PCR）或半巢式RT-PCR（semi-nested RT-PCR）进行．巢式PCR是在完成普通PCR的基础上继续扩增比普通PCR更小的片段，需要使用两对引物：第一对引物与普通PCR类似，一般上游引物与相应IgH和IgL基因的前导序列互补，下游引物与恒定区的序列互补，也可以选择针对重链恒定区的不同区域的混合下游引物来扩增不同类型的IgH．第二对引物称为巢式引物，其结合在第一次PCR产物的内部，使第二次PCR扩增的片段短于第一次扩增．巢式PCR的好处在于，如果第一次扩增产生了错误片断，则第二次能在错误片段上进行引物配对并扩增的概率极低．因此，巢式PCR的扩增非常特异．半巢式PCR只将普通PCR中的一个引物换成巢式引物，其扩增的片段长度介于普通PCR和巢式PCR之间．为了将重、轻链基因连接，在RT-PCR的过程中加入了重叠延伸的步骤（overlap-PCR）［36］．然后将连接的DNA片段导入相应表达载体中用于单抗的生产．

在过去的十年时间里，单个B细胞抗体技术受到越来越多的关注，通过接种、自然免疫捐赠者或者自身免疫病病人外周血淋巴细胞分离的方法获得了一些非常有价值的抗体，在疾病的诊断、药理学分析和临床研究中都起着重要作用．

［参考文献］

［1］WEINER L M．Fully human therapeutic monoclonal anti-bodies［J］．J Immunother，2006，29（1）：1－9．

［2］BOULIANNE G L，Hozumi N，Shulman M J．Production of functional chimaeric mouse/human antibody［J］．Na-

ture，1984，312（5995）：643－646．

［3］NAKANO K，ISHIGURO T，KONISHI H，et al．Genera-tion of a humanized anti-glypican3antibody by CDR

grafting and stability optimization［J］．Anticancer Drugs，

2010，21（10）：907－916．

［4］MICHAEL A，ROGUSKA PEDERSEN J T，KEDDY C A，et al．Humanization of murine monoclonal antibodies

through variable［J］．Prec Nail Acad Sci USA，1994：969

－973．

［5］MICHAEL A，ROGUSKA J T P，ANDREW H HENRY，et al．A comparison of two murine monoclonal antibodies

humanized by CDR-grafting and variable domain resurfa-

cing［J］．Protein Eng，1996：895－904．

［6］TICCHIONI M，BERNARD A，LEFRANC M P．Inhibi-tion of T cell activation with a humanized anti-beta1inte-

grin chain mAb［J］．Molecular Immunology，1995，32

（2）：101－116．

925

第5期向军俭，等：抗体技术研究进展（1）：人源抗体技术

［7］SEHLIN D，HEDLUND M，LORD A，et al．Heavy-chain complementarity-determining regions determine conforma-

tion selectivity of anti-abeta antibodies［J］．Neurodegener

Dis，2011，8（3）：117－123．

［8］COUTO J R，BLANK E W，PETERSON J A，et al．Anti-BA46monoclonal antibody Mc3：humanization using a

novel positional consensus and in vivo and in vitro charac-

terization［J］．Cancer Research，1995，55（8）：1717－

1722．

［9］ZHANG W，FENG J，LI Y，et al．Humanization of an anti-human TNF-alpha antibody by variable region resur-

facing with the aid of molecular modeling［J］．Molecular

Immunology，2005，42（12）：1445－1451．

［10］ROSOK M J，YELTON D E，HARRIS L J，et al．A com-binatorial library strategy for the rapid humanization of an-

ticarcinoma BR96Fab［J］．Journal of Biological Chemis-

try，1996，271（37）：22611－22618．

［11］BACA M，PRESTA L G，O'CONNOR S J，et al．Anti-body humanization using monovalent phage display［J］．

Journal of Biological Chemistry，1997，272（16）：10678

－10684．

［12］JESPERS LS，ROBERTS A，MAHLER S M，et al．Guid-ing the selection of human antibodies from phage display

repertoires to a single epitope of an antigen［J］．Biotech-

nology（N Y），1994，12（9）：899－903．

［13］王卓智，王琰，李竟，等．用抗原表位定向选择方法人源化抗TNF_抗体Fab段［J］．中华微生物学和

免疫学杂志，1998，18（6）：490－494．

［14］SMITH G P．Filamentous fusion phage：novel expression vectors that display cloned antigens on the virion surface

［J］．Science，1985，228（4705）：1315－1317．

［15］马巍娜，贾雷立，刘雪林，等．噬菌体抗体库技术在农兽药快速检测技术中的进展［J］．现代检验医学杂志，

2008，23（2）：83－84．

［16］乔媛媛，王琰．构建大容量噬菌体抗体库及获得人源抗体的策略［J］．中国生物制品学杂志，2007．20

（1）：65－68．

［17］SOLTES G，HUST M，NG K K，et al．On the influence of vector design on antibody phage display［J］．Journal of

Biotechnology，2007，127（4）：626－637．

［18］CHASTEEN L，AYRISS J，PAVLIK P，et al．Eliminating helper phage from phage display［J］．Nucleic Acids Res，

2006，34（21）：e145．

［19］MENG F M，ZHANG C H，AI Y C．Advances of devel-opment of phage display systems［J］．Hereditas（Bei-

jing），2011，33（10）：1113－1120．

［20］邓宁，向军俭，陈文吟，等．重组人源性抗HBsAgFab 抗体的特性分析［J］．暨南大学学报（自然科学版），

2004．25（5）：656－660．［21］MATTHEAKIS LC，B R，DOWER W J．An in vitro pol-ysome display system for identifying ligands from very

large peptide libraries［J］．Proc Natl Acad Sci U S A，

1994．

［22］LEVIN A M，WEISS G A．Optimizing the affinity and specificity of proteins with molecular display［J］．Mol Bi-

osyst，2006，2（1）：49－57．

［23］郑磊，李前伟．核糖体展示技术的研究与应用现状［J］．现代生物医学进展，2009：3753－3756．

［24］HANES J，PLUCKTHUN A．In vitro selection and evolu-tion of functional proteins by using ribosome display［J］．

Proc Natl Acad Sci U S A，1997，94（10）：4937－4942．［25］郭长占．转基因小鼠研究进展［J］．中华微生物学和免疫学杂志，2000，20（3）：278－282．

［26］BOSMA G C，CUSTER R P，BOSMA M J．A severe combined immunodeficiency mutation in the mouse［J］．

Nature，1983，301（5900）：527－530．

［27］刘庆丰，崔莲仙，何维，等．免疫重建SCID小鼠B淋巴母细胞瘤模型的建立［J］．中国医学科学院学报，

2003，25（3）：294－296．

［28］王军．SCID小鼠在制备人单克隆抗体中的应用［J］．国外医学免疫学分册，1993（4）：200－204．［29］TILLER T．Single B cell antibody technologies［J］．N Biotechnol，2011，28（5）：453－457．

［30］江培洲，沈新明，黄华，等．显微操作仪快速分离癌细胞并提取微量RNA的方法［J］．第一军医大学学

报，2002，22（6）：551－553．

［31］朱锋，陈钰．多参数流式细胞术诊断弥漫大B淋巴瘤相关噬血细胞综合征5例并文献复习［J］．中国

医药导报，2011，8（7）：116－121．

［32］LOVE J C，RONAN J L，GROTENBREG G M，et al．A microengraving method for rapid selection of single cells

producing antigen-specific antibodies［J］．Nat Biotechn-

ol，2006，24（6）：703－707．

［33］OGUNNIYI A O，STORY C M，PAPA E，et al．Screen-ing individual hybridomas by microengraving to discover

monoclonal antibodies［J］．Nat Protoc，2009，4（5）：

767－782．

［34］JIN A，OZAWA T，TAJIRI K，et al．A rapid and effi-cient single-cell manipulation method for screening anti-

gen-specific antibody-secreting cells from human periph-

eral blood［J］．Nat Med，2009，15（9）：1088－1092．［35］徐萌，绳波，刘志英，等．巢式RT_PCR法检测HIV_ 1阳性者中庚型肝炎病毒感染的研究［J］．北京医学，

2011，33（6）：467－469．

［36］符勇耀，李正国，李泮志，等．优化重叠PCR法进行单链抗体基因扩增和点突变［J］．生物技术通报，2009

（7）：150－155．

［责任编辑:黄建军］

035暨南大学学报（自然科学版）第33卷