实验室常用培养基

．常用培养基的制备
（1）马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）和马铃薯蔗糖琼脂（PSA）培养基培养真菌最常用的培养基，成分如下：
去皮马铃薯200 g 葡萄糖或蔗糖20g
琼脂15－20g 水1000 ml
配制方法：将马铃薯洗净去皮，称取200 g，切成小块（不必大小）放入锅中，加水1000ml，煮沸半小时，稍冷后用双层纱布过滤，在滤液中加蔗糖20g，加水补足到1000ml。

配成的培养基一般呈酸性，用于培养真菌，可以不必调pH。

如配制固体培养基，在加蔗糖前先加15－20g 琼胶加热熔化，最后加入蔗糖，混匀并加水补是至1000ml，趁热分装在试管或三角瓶中。

标准试管（15×150mm）分装量如下：一般用作斜面培养的每试管装培养基3－5ml，用作平面培养的每试管约10ml，加棉花塞后灭菌。

培养细菌用的培养基必须调节其酸度值到中性（pH7．0左右）。

（2）牛肉汁蛋白胨培养基（NA）是培养细菌最常用的培养基，又称营养琼脂或肉汤培养基。

成分如下：
酵母浸膏1g 牛肉浸膏3g
蛋白胨5-10g 蔗糖（或葡萄糖）l0g
琼脂15-20g 水1000ml
pH7.0
配制方法：称取牛肉浸膏及蛋白胨溶于少量热水中备用，在其余水中加入琼脂，加热溶化后将牛肉浸膏和蛋白胨溶液加入混匀，然后加水补足到1000 ml，用NaOH或HCL调整至pH7.0，趁热分装，加棉花塞后灭菌。

（3）玉米叶培养基取一定数量的玉米叶片，洗净后剪成1㎝2左右的小块，放在250ml的三角瓶中，盛放量一般为三角瓶的1／3，然后加少量的水以保持湿润，加棉花塞后灭菌。

天然培养基一般不必调整pH。

（4）查氏（Czapek）培养基查氏培养基是一种组合培养基，其成分如下：
NaNO3 2g K2HPO4 1 g
MgSO4·7H2O 0．5g KCl 0．5g
FeSO4 0．01g 蔗糖30g
水1000ml
（5）灭菌水的配制蒸馏水（或自来水）经过灭菌处理即成灭菌水，是实验室用量最大的必备品之一，常用于病原菌的分离、稀释、保湿等。

一般每试管装10ml的蒸馏水。

准备做系列稀释的灭菌水，每试管装9ml蒸馏水。

三角瓶也可分装灭菌水。

分装后的试管或三角瓶即可加棉花塞灭菌。

如果自来水中含氯量太高，必须用蒸馏水灭菌备用，否则影响微生物生长。

（二）消毒
1．器具的消毒玻璃缸、玻片、玻棒、刀剪等小型器具，洗净干燥后可用消毒剂擦拭，淋洗或浸泡消毒。

常用的消毒剂有75％乙醇、5 ％煤酚皂（Lysol）、0．25％新洁尔灭等。

保湿接种材料所用的玻璃缸，及上面加盖的玻璃板，可先用酒精涂擦，再用点燃的酒精棉球擦一遍。

利用酒精火焰消毒，同时将多余的酒精烧去。

2．工作场所的消毒为创造无菌条件进行微生物的分离，工作场所必须先进行消毒。

首先要做好室内特别是工作台的清洁工作，然后用水喷雾除去悬浮在空中的尘埃和微生物。

有条件的工作室可用水蒸气除尘。

较小的场所如无菌操作箱内可放一杯水，利用煮沸杯水时产生的蒸气除尘。

要求较严的场所如无菌室、无菌操作箱、超净工作台、培养箱等，可用漂白粉、甲醛、新洁尔灭、乙醇、石炭酸、煤酚皂等消毒剂的溶液擦洗或喷雾提高消毒效果。

必要时还可用紫外光灯照射消毒。

工作场所的空气消毒，可用石碳酸喷雾、甲醛熏蒸或硫磺熏蒸均能获得良好效果。

除尘消毒后的工作台上铺上湿纱布，并有次序地放好所需工具后就可以按预定的程序进行无菌操作。

3．分离材料的表面消毒分离病原物所用的病组织材料要先经表面消毒，去除或杀死粘附在表面的微生物，而保存病组织内部的病原物才能分离获得纯培养。

表面消毒的方法是将病组织小块放在消毒剂中浸泡一定时间，取出沥去残留表面的消毒剂，用灭菌水清洗后分离。

常用的表面消毒剂有0．1％升汞溶液，2－10％漂白粉溶液，或70％乙醇溶液等。

消毒前将病组织小块在70％乙醇溶液中浸5－10秒钟，驱除病组织表面的气泡，再放入0．1％升汞溶液处理2－5分钟让病组织与升汞溶液充分接触发挥消毒作用。

升汞的毒性很大，配制好的溶液要加蓝色或红色染料标记。

消毒后要用灭菌水清洗3次。

如不用升汞水消毒处理，也可用2—10％漂白粉溶液表面消毒，处理的时间一般为2-10分钟，也有长达30分钟。

因为漂白粉液中的氯气能自行挥发，消毒后一般不必清洗，但如漂白粉溶液不够澄清，可以用灭菌水洗去残留在病组织上的漂白粉微粒。

从枝干或肉质组织上分离病原物时，常用70％乙醇溶液擦拭或浸泡消毒。

也可以用酒精棉球涂擦分离部位再通过火焰将酒精烧去，如此反复1－2次，也可达到表面消毒甚至表面灭菌的效果。

（三）灭菌
１．高温灭菌
（1）火焰灭菌：直接用酒精灯或煤气灯的火焰烧灼器皿用具，灭菌彻底。

对于接种饵（环、针）、镊子等金属用具可烧灼至发红，在空气中冷却后即处于无菌状态。

玻棒、剪刀等可采用蘸酒精后通过火焰数次的方法达到灭菌的目的。

一些大的容器也可用少许酒精棉球涂擦烧灼的方法达到消毒或灭菌的要求。

（2）干热灭菌：使用干燥的热空气（176℃）保持1－2小时的方法杀死器皿中的微生物。

各种玻璃器皿（培养皿、吸管、金属器具等）均可用干燥灭菌法灭菌，但所有棉纱或化学纤维制品、橡胶制品、塑料制品、含水的培养基等，均不能用干热灭菌法，否则会被烤焦变形、变性或炸裂。

使用电热干燥箱（烘箱）干热灭菌时，应注意下列几点：
①所有玻璃器皿要洗净、擦干或晾干后包装好，以防烤焦和炸裂。

培养皿直接装入铝盒。

单支吸管用纸卷好，再装入铁筒。

②烘箱中不能装得太满，以总容量的2／3为限，上部1／3应留有空隙。

③物品不能直接放在底板上，尽量不放纸和棉纱等易燃物品，非用不可时千万不能与箱壁接触。

④升温时要打开排气孔，在保温时关闭。

灭菌后应让其自然降温至室温或低于60℃时才能取用，高温时不得打开箱门，以防炸裂。

（3）常压蒸气灭菌：此法是湿热灭菌的方法之一。

材料放在不能密封的容器中，利用水蒸气杀死微生物。

由于在常压下水蒸气的温度不超过100℃（在高海拔地区还要低些），因此并不能杀
死所有微生物，但适用于糖溶液、牛奶等培养基的灭菌。

巴斯德消毒法（Pasteurization）和间隙灭菌法都是常压蒸气灭菌法。

间隙灭菌法是将培养基等材料在常压下煮沸30分钟，然后放在28－30℃下培养24小时，每天煮沸一次，连续煮三次的方法，可以杀死包括芽孢在内所有的微生物，但不破坏或改变培养基的性质
（4）高压（蒸汽）灭菌：此法是微生物学中应用最广、效果最好的湿热灭菌法。

微生物的营养细胞在开水中即可被杀死，但有芽孢的细菌，常压下煮沸10分钟甚至2个小时也不死亡，要在加压的条件下提高温度才能全部杀死。

通常都是在1．05 ka ／cm 2或15磅/英寸2压力下保持20－30分钟。

在此压力条件下温度可达到121．5℃，可以杀死细菌芽孢。

水蒸汽的温度与压力高低呈正相关，但是如果高压灭菌锅内不全是水蒸汽而有空气，则同样压力条件下温度就低。

常见的高压灭菌锅有卧式、立式和手提式三种，压力锅上的压力表刻度有“公斤／平方厘米”（kg/cm2）和“磅／平方英寸”（lb/in2）两种。

使用高压锅的注意事项：
（1）水要加足以防烧干；
（2）加盖密封时对称地旋紧密封螺丝，用力要均匀，防止密封不好而漏气；
（3）加温时要打开放气阀，直至空气完全排空才关闭升压；
（4）灭菌结束后要逐渐地打开排气阀，缓缓放气降压，不能过快，以防培养基沸腾而冲出容器或弄湿棉塞。

放气降压打开锅盖要及时，否则相对延长了加压加热时间，易使培养基成分分解变质，引起pH 值的改变或产生沉淀物，同时容器上的棉花塞因长时间闷在水蒸气中，易被沾湿而增加污染的机会。

2．过滤除菌
一些不耐热的物质，在高温条件下会分解变质或失效，故不能用加热灭菌的方法，如抗菌素、血清、噬菌体、疫苗、糖类、氨基酸、维生素等，可采用特制的细菌滤器。

此外，还有空气过滤器，所用的材料是活性炭和棉花或玻璃纤维等，超净工作台的空气就是经过过滤除菌的纯净空气。

3．辐射灭菌
一定剂量的射线可以杀死微生物，常用的辐射处理方法有紫外线杀菌和电离辐射灭菌两类。

（1）紫外线灭菌波长在2600－2800Å（260－280nm）之间的紫外线具有很强的杀菌能力很低，在距离光源20-50厘米之内的微生物，经照射3－10分钟即可被完全杀死，但它的穿不能透过普通玻璃。

紫外线灭菌力。

紫外线灭菌灯广泛应用于超净工作台、无菌室、手术室、病房等场所的空气消毒与灭菌。

（2）电离辐射由放射性元素产生的射线如X-线、γ-线等都有很强的穿透力和杀菌力，各种罐头食品和中成药等材料均可用射线灭菌。

一般使用的照射剂量为40－60 kGy（戈瑞）或400-600万拉德（rad）。

3．化学灭菌
一些化学物质具有很强的杀菌和抑菌活性，如多种氧化剂或烷化剂，它们影响或破坏了微生物细胞的表面结构或内部生理活动，常用的如70％乙醇、0．1 ℅升汞、2-10％的漂白粉、0．5ppm 氯气、3％的双氧水、3－8％甲醛、0．1-0．5％高锰酸钾、0．1—0．25％的新洁尔灭、1％碘酒、5％的石炭酸或煤酚皂等。

此外还有0．2－0．5％过氧乙酸、生石灰、4％龙胆紫、0．01％硫柳汞等。

特殊条件下还可用溴甲烷或氯化苦、环氧乙烷等气体熏蒸做灭生性处理。