流式细胞术基本原理及应用完整版.ppt
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《流式细胞术贝克曼》课件
贝克曼流式细胞仪的应用
免疫学研究
贝克曼流式细胞仪在免疫学研究 中广泛应用，可以用于检测免疫 细胞的表面标志物、功能活性以
及免疫细胞的分选和培养等。
血液学研究
贝克曼流式细胞仪可以用于血液 学研究，检测血细胞的表面标志 物、血型抗原等，以及进行血细
胞的分选和培养等。
肿瘤研究
贝克曼流式细胞仪可以用于肿瘤 研究，检测肿瘤细胞的表面标志 物、肿瘤抗原等，以及进行肿瘤
辐射安全
废弃物处理
正确操作仪器，避免对实验人员造成辐射 伤害。
按照规定处理实验废弃物，确保实验室环 境的安全和环保。
贝克曼流式细胞仪的特点
高通量
贝克曼流式细胞仪具有高通量的 特点，能够在短时间内处理大量 细胞样本，提高了实验效率和检
测速度。
高灵敏度
贝克曼流式细胞仪采用先进的光电 检测技术，能够检测到微弱的荧光 信号，具有高灵敏度，能够检测到 低浓度的细胞标记物。
多参数分析
贝克曼流式细胞仪可以同时检测多 个参数，包括细胞大小、颗粒性、 荧光信号等，从而对细胞进行多维 度的分析和分选。
贝克曼流式细胞仪的原理
流式细胞术原理
流式细胞术是一种在液流中快速检测和分选细胞的技术。通 过将单个细胞与荧光染料结合，利用激光束激发荧光，并通 过光电倍增管检测荧光信号，实现对细胞的快速分析和分选 。
贝克曼流式细胞仪的原理
贝克曼流式细胞仪是应用流式细胞术的仪器之一，其原理是 将待测细胞与荧光染料结合后，通过高压液流将细胞送入流 动室，在流动室内与激光束相遇，激发荧光信号，并通过光 电倍增管进行检测和记录。
用于检测精子细胞和卵 子细胞的活性与质量。
流式细胞术的发展历程
20世纪70年代
流式细胞术原理及应用通用课件
抗菌药物敏感性测试
通过流式细胞术可以检测细菌对抗菌药物的敏感性，为临床合理用 药提供科学依据。
05 流式细胞术的数 据分析与解读
数据文件类型与读取方式
FCS文件
流式细胞术数据文件常用FCS格式，可以使用专业软件（如FlowJo、Cytobank 等）或编程语言（如R、Python等）读取和处理。
快速检测。
多参数分析：可同时检测细胞 的多个参数，如大小、形态、
内部结构、表面抗原等。
灵活性：可根据研究需求灵活 调整检测参数和实验方案。
流式细胞术的应用范围
01
02
03
04
05
基础医学研究
临床医学诊断
用于细胞生物学、免疫学、 辅助临床疾病的诊断、病
遗传学等领域的基础研究， 情评估和疗效观察，如白
历史发展
起源：流式细胞术起源于20世纪60年代，当时为了满足生物医学研 究中对细胞快速、准确分析的需求。
技术发展：随着激光技术、计算机科学和生物学的不断进步，流式细 胞术逐渐发展成为一项高精度、高通量的细胞分析技术。
技术原理与特点
技术原理
液态样本流动：将细胞悬浮于液体中，形成细胞悬液，通过微管道连续流动。
数据读取方式
数据读取方式分为文件导入和实时获取两种。文件导入方式是将存储在硬盘中的 FCS文件导入到分析软件中，而实时获取方式则是通过流式细胞仪与电脑连接， 直接将数据获取到分析软件中。
数据预处理与质量控制
数据清洗
去除噪声、杂质和不必要的信号，以减少分析时的干扰和误差。
补偿调 整
对于多色荧光染色，需要进行荧光补偿调整，以消除荧光染料间的 交叉干扰。
多模态流式细胞术
多模态流式细胞术允许在单个平台上整合多种检测技术，如荧光共振能量转移 （FRET）、质量细胞术等，从而提供更丰富的细胞信息。
通过流式细胞术可以检测细菌对抗菌药物的敏感性，为临床合理用 药提供科学依据。
05 流式细胞术的数 据分析与解读
数据文件类型与读取方式
FCS文件
流式细胞术数据文件常用FCS格式，可以使用专业软件（如FlowJo、Cytobank 等）或编程语言（如R、Python等）读取和处理。
快速检测。
多参数分析：可同时检测细胞 的多个参数，如大小、形态、
内部结构、表面抗原等。
灵活性：可根据研究需求灵活 调整检测参数和实验方案。
流式细胞术的应用范围
01
02
03
04
05
基础医学研究
临床医学诊断
用于细胞生物学、免疫学、 辅助临床疾病的诊断、病
遗传学等领域的基础研究， 情评估和疗效观察，如白
历史发展
起源：流式细胞术起源于20世纪60年代，当时为了满足生物医学研 究中对细胞快速、准确分析的需求。
技术发展：随着激光技术、计算机科学和生物学的不断进步，流式细 胞术逐渐发展成为一项高精度、高通量的细胞分析技术。
技术原理与特点
技术原理
液态样本流动：将细胞悬浮于液体中，形成细胞悬液，通过微管道连续流动。
数据读取方式
数据读取方式分为文件导入和实时获取两种。文件导入方式是将存储在硬盘中的 FCS文件导入到分析软件中，而实时获取方式则是通过流式细胞仪与电脑连接， 直接将数据获取到分析软件中。
数据预处理与质量控制
数据清洗
去除噪声、杂质和不必要的信号，以减少分析时的干扰和误差。
补偿调 整
对于多色荧光染色，需要进行荧光补偿调整，以消除荧光染料间的 交叉干扰。
多模态流式细胞术
多模态流式细胞术允许在单个平台上整合多种检测技术，如荧光共振能量转移 （FRET）、质量细胞术等，从而提供更丰富的细胞信息。
流式细胞术原理及应用新课件PPT全
流式细胞术是20世纪70年代发展起来的一种技术，有人将流式细胞仪比喻成高级的荧光显微镜。 HLA-B27: 强直性脊柱炎 细胞功能检测：细胞周期、凋亡
Flow Sorting 直方图适用于：单参数分析
SORTING（细胞分选） CD16+56 NK细胞 可利用FCM进行细胞周期分析，适当选择周期特异性药物或非周期特异性药物。
巨血小板
• 细胞凋亡与坏死的区别 一般只测一个参数、不能分选
5、DNA含量分析法（晚晚期）
2F时LO必W需C停Y用TO免M疫E抑TR制Y剂。虽然凋亡与坏死的最终结果极为相似，但
凋亡检测
每一步都有检测它试剂盒们的过程与表现却有很大差别。
光路调节系统固定，自动化程度高，操作简便，易学易掌握,适合
坏死（necrosis）：坏死是细胞受到强烈理 流式细胞分析在人类基因组计划中发挥了重要作用，流式细胞技术的应用也适用于植物，目前这个技术应用范围包括流式核型分析，
目前，该技术以广泛用于生物及医 学基础研究与临床检测，在分子生物学、 免疫学、遗传学、血液学、肿瘤学等领 域内发挥着重要作用。
流式细胞仪
荧光显微镜
Flow Cytometry
控制 一般只测一个参数、不能分选
电脑
人脑
其细胞及组织的变化与坏死有明显的不同。
可利用FCM进行细胞周期分析，适当选择周期特异性药物或非周期特异性药物。
• 空白对照：ALL 应用领域将不断开拓，成为科研与临床不可或缺的重要工具。
随着白细胞分化抗原意义的确认以及单克隆抗体技术的发展，随着人们创新意识的加强，结合计算机技术和其他技术，流式细胞仪的 应用领域将不断开拓，成为科研与临床不可或缺的重要工具。 坏死（necrosis）：坏死是细胞受到强烈理化或生物因素作用引起细胞无序变化的死亡过程。
流式细胞术和应用PPT培训课件
异荧光 细胞生长好、避免反复吹打
彻底消化
增加抗体量、延长反应时间
五、数据分析处理
WinMDI软件等。 单参数直方图 双参数二维点图 等高图 三维图
设门：
散点图
限定要分析的目的细胞群，FSC vs SSC点图是传统上用 于设门的图；
补偿模型图
补偿调节前后对比
二、荧光染料的选择
1.细胞表型分析 双色分析：FITC与PE 三色分析：双色分析+PE-CY5或 PerCP-CY5.5。 四色分析：三色分析+APC或PE-CY5。
2.胞内蛋白与周期的关系分析 蛋白标记：FITC或GFP，DNA标记：PI
3.凋亡与坏死分析： 凋亡用Annexin V-FITC，坏死用PI。
流式细 胞术和 应用
内容
一、流式细胞术工作原理 二、荧光染料选择 三、抗体选择 四、样品制备及对照设置 五、数据分析处理 六、流式细胞术的应用
一、流式细胞术工作原理
（一）流式细胞术的概念
流式细胞术（FCM，Flow Cytomytry）指利用流式 细胞仪(Flow Cytomyter)对处于快速流动的荧光染色的 细胞或生物颗粒进行多参数、快速的定量分析和分选 （纯度可达99%以上）的技术。凡是能被荧光素标记的 且这种荧光素能被流式细胞仪所配置的激光光源激发的 细胞或颗粒，都可用流式细胞仪检测。
PE-Cy5与APC干扰。
二、荧光染料的选择
488nm激光激发的染料： FITC：异硫氰酸荧光素，绿色，513nm PE：藻红素，橙黄色 575nm，信号最强 PerCP ：多甲藻黄素-叶绿素蛋白，深红色，675nm PE-Cy5 (PC5) ：670nm PE-Cy5.5 (PC5.5)：667nm PE-Cy7 (PC7) ：767nm PI (碘化丙啶）：617nm
彻底消化
增加抗体量、延长反应时间
五、数据分析处理
WinMDI软件等。 单参数直方图 双参数二维点图 等高图 三维图
设门：
散点图
限定要分析的目的细胞群，FSC vs SSC点图是传统上用 于设门的图；
补偿模型图
补偿调节前后对比
二、荧光染料的选择
1.细胞表型分析 双色分析：FITC与PE 三色分析：双色分析+PE-CY5或 PerCP-CY5.5。 四色分析：三色分析+APC或PE-CY5。
2.胞内蛋白与周期的关系分析 蛋白标记：FITC或GFP，DNA标记：PI
3.凋亡与坏死分析： 凋亡用Annexin V-FITC，坏死用PI。
流式细 胞术和 应用
内容
一、流式细胞术工作原理 二、荧光染料选择 三、抗体选择 四、样品制备及对照设置 五、数据分析处理 六、流式细胞术的应用
一、流式细胞术工作原理
（一）流式细胞术的概念
流式细胞术（FCM，Flow Cytomytry）指利用流式 细胞仪(Flow Cytomyter)对处于快速流动的荧光染色的 细胞或生物颗粒进行多参数、快速的定量分析和分选 （纯度可达99%以上）的技术。凡是能被荧光素标记的 且这种荧光素能被流式细胞仪所配置的激光光源激发的 细胞或颗粒，都可用流式细胞仪检测。
PE-Cy5与APC干扰。
二、荧光染料的选择
488nm激光激发的染料： FITC：异硫氰酸荧光素，绿色，513nm PE：藻红素，橙黄色 575nm，信号最强 PerCP ：多甲藻黄素-叶绿素蛋白，深红色，675nm PE-Cy5 (PC5) ：670nm PE-Cy5.5 (PC5.5)：667nm PE-Cy7 (PC7) ：767nm PI (碘化丙啶）：617nm
流式细胞术原理及应用课件
• DAPI（4,4,6-二脒基二苯基吲哚 358, 456） 可以非嵌入方式与DNA链上的 A-T碱基对特异性结合。变异系数明显小于其他染料，一种理想的DNA定 量染料。
• Hoechst（343, 450）常见为Hoechst33342和Hoechst33258，非嵌入的方式 与DNA链上的A-T碱基对结合。能对活细胞染色，用于活细胞DNA定量 分析，如精子分选；还用于侧群细胞的分选。
实验步骤： •细胞处理（全血，培养的细胞） •染色（室温，20min） •离心洗涤（全血裂红） •上机检测
PPT学习交流
22
1)荧光素的选择：
• A、根据机器配置选择荧光素 • 多色标记荧光素搭配原则：每个通道只能选择一种荧光素；各个通道之间的
荧光素可以随意搭配。 FACSCalibur常用四色搭配：FITC、PE、PerCP、APC。
PPT学习交流
16
PPT学习交流
17
二、荧光素
•荧光的概念：
＜
激发波长 Excitation wavelength
发射波长(荧光波长) Emission wavelength
PPT学习交流
18
•激发光谱：特异性地激发某种荧光素的一定波长范围内的光 •发射光谱：某一波长激发光引起荧光素发射的荧光
PPT学习交流
8
光学系统
透镜、滤光片、小孔； LP：long-pass filter BP：band-pass filter
460 500 540
SP：short-pass filter
LP 500
SP 500
BP500/50
PPT学习交流
9
信号检测与分析系统
物理参数 •FSC：前向角散色光， 代表细胞大小 •SSC：侧向角散色光，代表细胞颗粒度
• Hoechst（343, 450）常见为Hoechst33342和Hoechst33258，非嵌入的方式 与DNA链上的A-T碱基对结合。能对活细胞染色，用于活细胞DNA定量 分析，如精子分选；还用于侧群细胞的分选。
实验步骤： •细胞处理（全血，培养的细胞） •染色（室温，20min） •离心洗涤（全血裂红） •上机检测
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1)荧光素的选择：
• A、根据机器配置选择荧光素 • 多色标记荧光素搭配原则：每个通道只能选择一种荧光素；各个通道之间的
荧光素可以随意搭配。 FACSCalibur常用四色搭配：FITC、PE、PerCP、APC。
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二、荧光素
•荧光的概念：
＜
激发波长 Excitation wavelength
发射波长(荧光波长) Emission wavelength
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•激发光谱：特异性地激发某种荧光素的一定波长范围内的光 •发射光谱：某一波长激发光引起荧光素发射的荧光
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光学系统
透镜、滤光片、小孔； LP：long-pass filter BP：band-pass filter
460 500 540
SP：short-pass filter
LP 500
SP 500
BP500/50
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信号检测与分析系统
物理参数 •FSC：前向角散色光， 代表细胞大小 •SSC：侧向角散色光，代表细胞颗粒度
流式细胞术精品PPT课件
4
四、 流式细胞术的应用
1 细胞DNA含量检测：
细胞固定后用PI染色，因为PI特 异性结合于细胞DNA，荧光强度与PI 的结合量呈良好的线性关系，根据这 个原理，并通过专用的DNA分析软件， 可测出细胞的DNA含量。用于细胞周 期、细胞倍体以及凋亡的检测。
5
• 肿瘤诊断：
•
DNA异倍体的出现是癌变的一个重
• 一、 流式细胞术的概念 流式细胞术（FCM）就是对在的鞘
液包括下的细胞、粒子进行分析和分选 的技术，这种细胞或粒子是经过特异荧 光标记的。其特点是测量速度快，每秒 钟能测数千个乃至上万个细胞，且可进 行多参数测量，另一特点是在分析的同 时可把具有指定特征的细胞分离出来， 这就是分选技术。
1
二、流式细胞仪的工作原理
产生及发展，现在CD系统已有247种之多。
细胞用带有荧光的单克隆抗体标记后，用
流式细胞仪可对其进行检测分析，可分析
出荧光细胞的含量，也可分析出这种阳性
细胞的CD分子的相对含量。标记的方法一
般用直标法，也可用间标法。荧光探针多
为FITC、PE、PE-CY5、PerCP、CY5、
APC等。
9
淋巴细胞分类：
•
红细胞表面CD59缺失
18
5 细胞内蛋白的分析：
•
细胞破膜后将细胞内某一蛋白成分进行荧
光标记，用流式细胞仪进行测量分析，同表型
分析一样，可以测量出这种阳性细胞的数量和
这种蛋白的相对含量。并且，结合细胞表型分
析，进行多标记和多参数分析，可以检测出含
这种蛋白的细胞是属于哪一种表型的细胞。多
用间标法，荧光探针多为FITC。也可以与周期
27
•
流式细胞仪对一个样品提供的结果是否可
四、 流式细胞术的应用
1 细胞DNA含量检测：
细胞固定后用PI染色，因为PI特 异性结合于细胞DNA，荧光强度与PI 的结合量呈良好的线性关系，根据这 个原理，并通过专用的DNA分析软件， 可测出细胞的DNA含量。用于细胞周 期、细胞倍体以及凋亡的检测。
5
• 肿瘤诊断：
•
DNA异倍体的出现是癌变的一个重
• 一、 流式细胞术的概念 流式细胞术（FCM）就是对在的鞘
液包括下的细胞、粒子进行分析和分选 的技术，这种细胞或粒子是经过特异荧 光标记的。其特点是测量速度快，每秒 钟能测数千个乃至上万个细胞，且可进 行多参数测量，另一特点是在分析的同 时可把具有指定特征的细胞分离出来， 这就是分选技术。
1
二、流式细胞仪的工作原理
产生及发展，现在CD系统已有247种之多。
细胞用带有荧光的单克隆抗体标记后，用
流式细胞仪可对其进行检测分析，可分析
出荧光细胞的含量，也可分析出这种阳性
细胞的CD分子的相对含量。标记的方法一
般用直标法，也可用间标法。荧光探针多
为FITC、PE、PE-CY5、PerCP、CY5、
APC等。
9
淋巴细胞分类：
•
红细胞表面CD59缺失
18
5 细胞内蛋白的分析：
•
细胞破膜后将细胞内某一蛋白成分进行荧
光标记，用流式细胞仪进行测量分析，同表型
分析一样，可以测量出这种阳性细胞的数量和
这种蛋白的相对含量。并且，结合细胞表型分
析，进行多标记和多参数分析，可以检测出含
这种蛋白的细胞是属于哪一种表型的细胞。多
用间标法，荧光探针多为FITC。也可以与周期
27
•
流式细胞仪对一个样品提供的结果是否可
流式细胞术原理及临床应用-PPT文档
FCM检测白血病微小残留病变(MRD):
MRD 是 白 血 病 复 发 的 主 要 根 源 ， FCM 的 高 特 异性和敏感性可以在患者缓解期检测是否有残 留病变细胞，早期探测MRD，以免复发
FCM在临床肿瘤学中的应用
1.血液标本的检查 ● 肿瘤患者的免疫功能检查 ● 肿瘤患者的粘附分子检查：在肿瘤的浸润与转
细胞凋亡的生物学意义
胚胎形成、肌体正常发 育、衰老和损伤细胞的清 除以及肿瘤的发生、发展 和转归等都与细胞凋亡有 关。
生物医学的研究热点
FCM在血栓性疾与止血中应用
由于活化血小板是血栓的主要
成分之一，血小板活化程度的增 高与疾病的发生发展有关。 利用 流式细胞仪可检测血小板活化指 标，了解血小板状态和活化进程 。 巨血小板 血小板无力症 网织血 小板
肿瘤细胞耐药性
MDR是由多药耐药基因编码的P糖蛋白（P-gp） 亲脂化合物，包括多种抗癌药物和荧光染料的跨膜性 排出泵。当淋巴细胞出现MDR阳性细胞时，患者对 化疗药物开始出现耐
细胞凋亡是由基因控制的细胞自主的有序 的死亡。它涉及一系列基因的激活、表达以及调 控等的作用；是为更好地适应生存环境而主动争 取的一种死亡过程。 坏死（necrosis）：坏死是细胞受到强烈理化或 生物因素作用引起细胞无序变化的死亡过程。表 现为细胞胀大，胞膜破裂，细胞内容物外溢，核 变化较慢，DNA 降解不充分，引起局部严重的 炎症反应
可用流式细胞仪分析的标本
外周血、骨髓、癌组织、癌旁组织、各种体液 （尿、脑脊液、胸腹水、肺泡灌洗液等）
单细胞生物、特殊处理的植物细胞、某些非细胞 粒子、可溶性分子
流式细胞仪的基本功能
•细胞表型分析：包括细胞膜、胞浆内蛋白表达及核膜成份分析 •DNA含量及细胞周期分析、细胞凋亡检测 •目标细胞分选 •自身免疫性疾病相关HLA抗原分析、自身抗体的检测 •流式蛋白定量技术：血浆中各种细胞因子的含量
流式细胞术基本原理(完整)PPT参考幻灯片
流式细胞术的基本原理
1
流式细胞术（flow cytometer，FCM）：
利用流式细胞仪对处于快速直线流动状态 中的单列细胞或生物颗粒进行逐个、多参 数、快速的定性、定量分析或分选的技术。
2
流式细胞仪：是集现代物理电子技术、激光
技术、光电测量技术、计算机技术以及细 胞荧光化学技术、单克隆抗体技术于一体 的先进科学技术设备
34Leabharlann 流式细胞仪分为四部分：1）流动室与液流系统 2）光源与光学系统 3）信号收集、转换与分析系统 4）细胞分选系统
5
1）流动室与液流系统
6
2）光源与光学系统
激光（单色性、单向性） 前向散射（FSC）
侧向散射（SSC）
7
激发波长 发射波长
8
3）信号收集、转换与分析系统
• 激发波长经过滤光片分离不同波长的光信 号分别到达不同的光电倍增管(PMT)，PMT 将光信号转换成电信号，电信号输入到放 大器放大。
11
流式细胞术的对照设置
阴性对照：调节荧光探测器合适的放大倍 数，将仪器归零，确定样本的基础荧光域 值
阳性对照：检测抗体是否有问题或确定实 验方法的稳定性、准确性
空白对照：不标记，自发荧光 PS：补偿对照：多色分析样本时为荧光光谱
重叠进行的的补偿调节
12
4）细胞分选系统
• 根据某参数决定细胞液滴是否被分选，然 后由充电电路对其充电，带电液滴通过静 电场发生偏转而分离
488 nm laser
- Charged Plates
Single cells sorted into test tubes
FALS Sensor Fluorescence detector
+
1
流式细胞术（flow cytometer，FCM）：
利用流式细胞仪对处于快速直线流动状态 中的单列细胞或生物颗粒进行逐个、多参 数、快速的定性、定量分析或分选的技术。
2
流式细胞仪：是集现代物理电子技术、激光
技术、光电测量技术、计算机技术以及细 胞荧光化学技术、单克隆抗体技术于一体 的先进科学技术设备
34Leabharlann 流式细胞仪分为四部分：1）流动室与液流系统 2）光源与光学系统 3）信号收集、转换与分析系统 4）细胞分选系统
5
1）流动室与液流系统
6
2）光源与光学系统
激光（单色性、单向性） 前向散射（FSC）
侧向散射（SSC）
7
激发波长 发射波长
8
3）信号收集、转换与分析系统
• 激发波长经过滤光片分离不同波长的光信 号分别到达不同的光电倍增管(PMT)，PMT 将光信号转换成电信号，电信号输入到放 大器放大。
11
流式细胞术的对照设置
阴性对照：调节荧光探测器合适的放大倍 数，将仪器归零，确定样本的基础荧光域 值
阳性对照：检测抗体是否有问题或确定实 验方法的稳定性、准确性
空白对照：不标记，自发荧光 PS：补偿对照：多色分析样本时为荧光光谱
重叠进行的的补偿调节
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4）细胞分选系统
• 根据某参数决定细胞液滴是否被分选，然 后由充电电路对其充电，带电液滴通过静 电场发生偏转而分离
488 nm laser
- Charged Plates
Single cells sorted into test tubes
FALS Sensor Fluorescence detector
+
流式细胞术原理及应用 ppt课件
• 荧光染料/荧光化合物 PI、7-AAD等插入核酸链中； CFSE和蛋白质共价结合；
– 荧光蛋白-如GFP、RFP、YFP、CFP、mCherry、DsRed等，自身发荧 光。
ppt课件
19
常用荧光素
ppt课件
20
常用荧光染料
• PI（碘化丙啶 535, 623） 可选择性的插入核酸双螺旋碱基对中。常用于 DNA分析，需要用RNase处理细胞排除RNA对DNA荧光定量的影响；PI 不能透过活细胞膜，常用于鉴定死细胞。
ppt课件
10
• 实验中，常利用FSC和SSC这两种参数的组合，区分不同的细 胞群体，去除碎片、死细胞和粘连细胞的干扰。
红细胞、死细胞和碎片
ppt课件
粒细胞 单核细胞 淋巴细胞
11
• 阈值：溶液中的杂质或者死细胞，很容易产生微小的干扰信 号，所以必须设置阈值，排除杂质、细胞碎片或体积较小的 死细胞。
•横坐标：道数
•横坐标：某细胞参数
•纵坐标：细胞数
相对含量
•纵坐标：该细胞另一
参数含量
等高线图（Contour Plot）
ppt课件
15
细胞分选系统
• 电荷式分选 超声振动器(15-100kHz) 液流充电系统 高压偏转板 收集装置(流式管、离心 管、培养板、载波片等)
MACS ®技术：Magetic Activated Cell Sorting 免疫学+细胞生物学+磁力学
RNA呈橙黄色荧光，可进行DNA/RNA双参数分析。
ppt课件
21
三、如何设计流式实验
准备工作： •确定实验要检测的marker •选择合适的荧光素标记的抗体 •选择合适的同型对照抗体
– 荧光蛋白-如GFP、RFP、YFP、CFP、mCherry、DsRed等，自身发荧 光。
ppt课件
19
常用荧光素
ppt课件
20
常用荧光染料
• PI（碘化丙啶 535, 623） 可选择性的插入核酸双螺旋碱基对中。常用于 DNA分析，需要用RNase处理细胞排除RNA对DNA荧光定量的影响；PI 不能透过活细胞膜，常用于鉴定死细胞。
ppt课件
10
• 实验中，常利用FSC和SSC这两种参数的组合，区分不同的细 胞群体，去除碎片、死细胞和粘连细胞的干扰。
红细胞、死细胞和碎片
ppt课件
粒细胞 单核细胞 淋巴细胞
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• 阈值：溶液中的杂质或者死细胞，很容易产生微小的干扰信 号，所以必须设置阈值，排除杂质、细胞碎片或体积较小的 死细胞。
•横坐标：道数
•横坐标：某细胞参数
•纵坐标：细胞数
相对含量
•纵坐标：该细胞另一
参数含量
等高线图（Contour Plot）
ppt课件
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细胞分选系统
• 电荷式分选 超声振动器(15-100kHz) 液流充电系统 高压偏转板 收集装置(流式管、离心 管、培养板、载波片等)
MACS ®技术：Magetic Activated Cell Sorting 免疫学+细胞生物学+磁力学
RNA呈橙黄色荧光，可进行DNA/RNA双参数分析。
ppt课件
21
三、如何设计流式实验
准备工作： •确定实验要检测的marker •选择合适的荧光素标记的抗体 •选择合适的同型对照抗体
流式细胞术的基本原理及其应用ppt课件
4
流式细胞仪基本结构 流动室与液流系统
光源与光学系统 信号收集与信号转换系统
计算机与分析系统
分选系统
5
流式细胞仪的液流系统
6
流式细胞仪的光学系统
光电转换器件
流动室
检测点Biblioteka 激光器7流式细胞仪的光信号
1. 散色光信号
前向角散色（Forward Scatter，FSC）
小角散色，与细胞直径成近似直线关系。
荧光染料 激发波长/nm 发射波长/nm
颜色
FITC
488
525
绿色
PE
488
575
橙黄色
PerCP
488
677
深红色
APC
633
660
红色
11
12
四种激光器 355nm 405nm 488nm 633nm
可进行多达10色以 上的多色荧光分析
BD LSR Ⅱ
13
流式细胞术的应用
❖ 细胞表面分子 ❖ 细胞内或细胞核内抗原 ❖ 细胞凋亡 ❖ DNA含量检测与细胞周期的分析 ❖ 细胞增殖 ❖ 细胞毒的检测与分析 ❖ 可溶性蛋白分子 ❖ 报告基因 ❖ 其它
流式细胞术基本原理及应用
漆冬梅
1
❖流式细胞仪（flow cytometer）
是一种集激光技术、电子物理技术、光电测量技术、 电子计算机以及细胞荧光化学技术、单克隆抗体技术 为一体的新型高科技仪器。
大型机、科研型
台式机、临床型
2
目前最新型流式仪
3
❖流式细胞术（flow cytometry）
利用流式细胞仪对处于快速直线流动状态中的单列 细胞或生物颗粒进行多参数、快速的定性、定量分 析或分选的技术。
流式细胞仪基本结构 流动室与液流系统
光源与光学系统 信号收集与信号转换系统
计算机与分析系统
分选系统
5
流式细胞仪的液流系统
6
流式细胞仪的光学系统
光电转换器件
流动室
检测点Biblioteka 激光器7流式细胞仪的光信号
1. 散色光信号
前向角散色（Forward Scatter，FSC）
小角散色，与细胞直径成近似直线关系。
荧光染料 激发波长/nm 发射波长/nm
颜色
FITC
488
525
绿色
PE
488
575
橙黄色
PerCP
488
677
深红色
APC
633
660
红色
11
12
四种激光器 355nm 405nm 488nm 633nm
可进行多达10色以 上的多色荧光分析
BD LSR Ⅱ
13
流式细胞术的应用
❖ 细胞表面分子 ❖ 细胞内或细胞核内抗原 ❖ 细胞凋亡 ❖ DNA含量检测与细胞周期的分析 ❖ 细胞增殖 ❖ 细胞毒的检测与分析 ❖ 可溶性蛋白分子 ❖ 报告基因 ❖ 其它
流式细胞术基本原理及应用
漆冬梅
1
❖流式细胞仪（flow cytometer）
是一种集激光技术、电子物理技术、光电测量技术、 电子计算机以及细胞荧光化学技术、单克隆抗体技术 为一体的新型高科技仪器。
大型机、科研型
台式机、临床型
2
目前最新型流式仪
3
❖流式细胞术（flow cytometry）
利用流式细胞仪对处于快速直线流动状态中的单列 细胞或生物颗粒进行多参数、快速的定性、定量分 析或分选的技术。
流式细胞术的原理及应用ppt课件
➢可把感兴趣细胞分 选到特定培养孔或板 上（4路和24孔板）
➢适用于高速分选和 多色分析
6
在整堂课的教学中，刘教师总是让学 生带着 问题来 学习， 而问题 的设置 具有一 定的梯 度，由 浅入深 ，所提 出的问 题也很 明确
流式细胞仪检测范围
细胞大小
细胞粒度
细 细胞表面面积
胞 结
核浆比例
构 DNA含量与细胞周期
18
在整堂课的教学中，刘教师总是让学 生带着 问题来 学习， 而问题 的设置 具有一 定的梯 度，由 浅入深 ，所提 出的问 题也很 明确
散射光
它反应细胞的物理特性,根据前侧向散射光，可以把不同 类型的细胞群加以区分
FSC（小角散射光)它反 应细胞的相对大小和截 面积的大小
SSC (90度角散射光)代 表细胞的颗粒度和精细 结构的变化
1.液流系统： 细胞悬液被吸入检测室后，在鞘液
(sheath)的约束下，通过喷嘴，使其形成单细 胞悬液。
10
在整堂课的教学中，刘教师总是让学 生带着 问题来 学习， 而问题 的设置 具有一 定的梯 度，由 浅入深 ，所提 出的问 题也很 明确
2.光学系统： 激光是较常用的光源, 稳定性好、单色性好。 散射光和荧光信号被收集、处理转化为数字信号。
FACS Vantage DiVa
科研型（大型机）
特点： ➢多数字化 ➢适用于各类细胞分选 ➢4路分选
5
在整堂课的教学中，刘教师总是让学 生带着 问题来 学习， 而问题 的设置 具有一 定的梯 度，由 浅入深 ，所提 出的问 题也很 明确
FACSAria
科研型
特点： ➢分辨率高
➢选配多种波长和类 型激光器
成,将产生的光信号引导至检测器
➢适用于高速分选和 多色分析
6
在整堂课的教学中，刘教师总是让学 生带着 问题来 学习， 而问题 的设置 具有一 定的梯 度，由 浅入深 ，所提 出的问 题也很 明确
流式细胞仪检测范围
细胞大小
细胞粒度
细 细胞表面面积
胞 结
核浆比例
构 DNA含量与细胞周期
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在整堂课的教学中，刘教师总是让学 生带着 问题来 学习， 而问题 的设置 具有一 定的梯 度，由 浅入深 ，所提 出的问 题也很 明确
散射光
它反应细胞的物理特性,根据前侧向散射光，可以把不同 类型的细胞群加以区分
FSC（小角散射光)它反 应细胞的相对大小和截 面积的大小
SSC (90度角散射光)代 表细胞的颗粒度和精细 结构的变化
1.液流系统： 细胞悬液被吸入检测室后，在鞘液
(sheath)的约束下，通过喷嘴，使其形成单细 胞悬液。
10
在整堂课的教学中，刘教师总是让学 生带着 问题来 学习， 而问题 的设置 具有一 定的梯 度，由 浅入深 ，所提 出的问 题也很 明确
2.光学系统： 激光是较常用的光源, 稳定性好、单色性好。 散射光和荧光信号被收集、处理转化为数字信号。
FACS Vantage DiVa
科研型（大型机）
特点： ➢多数字化 ➢适用于各类细胞分选 ➢4路分选
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在整堂课的教学中，刘教师总是让学 生带着 问题来 学习， 而问题 的设置 具有一 定的梯 度，由 浅入深 ，所提 出的问 题也很 明确
FACSAria
科研型
特点： ➢分辨率高
➢选配多种波长和类 型激光器
成,将产生的光信号引导至检测器
《流式细胞术》课件
抗体标记
利用特异性抗体与细胞表面抗原结合，将荧光染料标记在细胞上。
细胞分选的原理
流体动力学
通过调整液流速度和压力，控制细胞通过喷嘴的速度 。
静电场
在流动室中施加静电场，使带电的荧光微球和细胞偏 转至收集管中。
声波振荡
利用声波振荡器产生振动，使细胞在流动室中分散并 均匀分布。
数据分析与解读
数据获取
荧光染料干扰
荧光染料可能会产生交叉干扰或淬灭现象， 影响实验结果的准确性。
技术展望与未来发展
1 新技术应用
随着新技术的不断发展，如纳米技术、基因编辑等，流 式细胞术有望在检测灵敏度、特异性及多参数分析等方 面取得突破性进展。
2 人工智能辅助数据分析
随着新技术的不断发展，如纳米技术、基因编辑等，流 式细胞术有望在检测灵敏度、特异性及多参数分析等方 面取得突破性进展。
收集流式细胞仪产生的荧光信号和散射光信号 数据。
数据处理
利用软件对数据进行处理，包括去背景、校正 和归一化等操作。
结果解读
根据数据分析结果，解读细胞的表型、功能和活性等信息。
03
实验操作流程
样品制备
样品来源
流式细胞术的样品主要来自各类组织、血液 、培养细胞等。
样品处理
样品需要经过一系列的处理，如离心、洗涤 、细胞分离等，以去除杂质并获得纯净的细 胞样品。
3 个性化医疗应用
随着新技术的不断发展，如纳米技术、基因编辑等，流 式细胞术有望在检测灵敏度、特异性及多参数分析等方 面取得突破性进展。
4 拓展应用领域
随着新技术的不断发展，如纳米技术、基因编辑等，流 式细胞术有望在检测灵敏度、特异性及多参数分析等方 面取得突破性进展。
感谢您的观看
利用特异性抗体与细胞表面抗原结合，将荧光染料标记在细胞上。
细胞分选的原理
流体动力学
通过调整液流速度和压力，控制细胞通过喷嘴的速度 。
静电场
在流动室中施加静电场，使带电的荧光微球和细胞偏 转至收集管中。
声波振荡
利用声波振荡器产生振动，使细胞在流动室中分散并 均匀分布。
数据分析与解读
数据获取
荧光染料干扰
荧光染料可能会产生交叉干扰或淬灭现象， 影响实验结果的准确性。
技术展望与未来发展
1 新技术应用
随着新技术的不断发展，如纳米技术、基因编辑等，流 式细胞术有望在检测灵敏度、特异性及多参数分析等方 面取得突破性进展。
2 人工智能辅助数据分析
随着新技术的不断发展，如纳米技术、基因编辑等，流 式细胞术有望在检测灵敏度、特异性及多参数分析等方 面取得突破性进展。
收集流式细胞仪产生的荧光信号和散射光信号 数据。
数据处理
利用软件对数据进行处理，包括去背景、校正 和归一化等操作。
结果解读
根据数据分析结果，解读细胞的表型、功能和活性等信息。
03
实验操作流程
样品制备
样品来源
流式细胞术的样品主要来自各类组织、血液 、培养细胞等。
样品处理
样品需要经过一系列的处理，如离心、洗涤 、细胞分离等，以去除杂质并获得纯净的细 胞样品。
3 个性化医疗应用
随着新技术的不断发展，如纳米技术、基因编辑等，流 式细胞术有望在检测灵敏度、特异性及多参数分析等方 面取得突破性进展。
4 拓展应用领域
随着新技术的不断发展，如纳米技术、基因编辑等，流 式细胞术有望在检测灵敏度、特异性及多参数分析等方 面取得突破性进展。
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Detector Parameter
FL1 FL2 FL3 FL4
Filter
530/30 585/42 670LP 661/16
23
Electronics
—Converts analog signals to proportional digital signals
—Computes Height for each pulse —Calculates width and area —Interfaces with the computer for data transfer
60 mL/min
Laminar Flow
Sheath
Sheath
Sample
18
Sheath
Sheath
Sample
Review Question
Which of the following would cause disturbance in the laminar flow of the optical cuvette?
24
Creation of a Voltage Pulse - Analog Signal
Voltage
Laser Laser Laser
25
Voltage
Voltage
Time Time Time
Quantification of a Voltage Pulse
— Height is a measurement for all parameters. — Width = Area/Height
fluidic stream
• Collection optics consist of:
Filters that direct the signals to the appropriate optical detectors
20
Optical Filters
Longpass
460 500 540
Pulse Area
0 Pulse
Width Time
26
Volts
Pulse Height
Effect of the Instrument
Controls on the Data
Detecto r
Instrument Controls
FSC detector 250 gain
13
Freq
Two-Color Cell Analysis
Which of the three populations has the most Ab A binding sites?
Ab A
14
Ab B
双色荧光散Leabharlann 图15现代流式细胞仪包括
—液流系统
聚焦细胞以供检测
—光学系统
激发和收集光信号
—电子系统
Shortpass
460 500 540
Bandpass
460 500 540
LP 500
SP 500
BP500/50
21
FACSCalibur光路图
22
Optics
Laser 488 nm
635 nm
Fluorochromes
FITC PE PerCP APC
GFP PI PerCP-CY5.5
A. bubbles B. cellular concentration C. sample flow rate
19
Optics
• Excitation optics consist of:
Lasers Lenses and mirrors that route the laser light to the
9
散点图——Dot Plot
lysed whole blood
10
Review Question
Dead cells are known to be smaller and to exhibit more internal complexity than live cells. Which of the populations on this plot would you expect to be dead?
研究的微粒特性包括多种物理及生物学特征，并加以 定量
2
流式细胞仪系统
简介 —通过流式细胞仪我们可以得到以下信息
- 相对细胞大小 - 相对细胞颗粒密度和内部复杂度 - 染色过细胞的相对荧光强度
3
Fluorescence signals
Focused laser beam
4
Injector Tip
6
前向角散射光 ——FSC
—Forward Angle Light Scatter
Laser
FALS Sensor
7
侧向角散射光——SSC
Laser
FALS Sensor
90LS Sensor
8
散射光
—散射光能被用来区分不同细胞群体的基本形态 上的差异 - 通常使用“散点图”来看散射光信号 - 散点图上的一个点就代表一个细胞颗粒的 数据
将光信号转化为电信号，并使其数字化以供 计算机分析
16
液流系统
— 液流系统将样本悬液聚焦在光源的中心处
17
Sample Flow in Optical Cuvette
Low Sample Flow Rate
12 mL/min
Optical Cuvette
Laminar Flow
High Sample Flow Rate
11
2. 荧光信号
荧光素吸收激光能量 荧光素将吸收能量释放，转换为
振动能和热能 释放较入射光波长更长的光量子
荧光素与特异抗体结合 荧光抗体与细胞抗原结合越多，产生的荧光信
号越强
12
荧光检测器
FALS Sensor
Fluorescence
Fluorescence detector (PMT3, PMT4 etc.)
Sheath fluid
流式细胞仪的光信号
—散射光信号 —荧光信号
5
1. 散射光信号
•前向角散射光（FSC,Forward
Scatter） 入射激光的同向散射光信号 细胞相 对大小及其表面积。
•侧向角散射（SSC, Side Scatter）
入射激光90角的散射光信号 细胞粒度及细胞内相对复杂性。
流式细胞术原理及应用
For FCM Training
流式细胞术
流式细胞术（Flow Cytometry, 简称FCM）是一种可 以快速、准确、客观，并且同时检测单个微粒（通常 是细胞）的多项特性的技术，同时可以对特定群体加 以分选
研究对象为生物颗粒，如各种细胞、染色体、微生物、 及人工合成微球等