反相高效液相色谱法测定乳清蛋白中的α-乳白蛋白和β-乳球蛋白

#" 结ห้องสมุดไป่ตู้与讨论
# ! !" "#$% 条件的选择 * * 乳清蛋白中的 ! / 乳 白 蛋 白 是 牛 奶 蛋 白 质 中 分 子 质 量 最 小的， 其相对分子质量为 $) $#)［ - ］， 由 $!+ 个氨基酸残基组 成 的单体球蛋 白。 " / 乳 球 蛋 白 是 由 $&! 个 氨 基 酸 残 基 折 叠 成 的紧密球状结 构， 相 对 分 子 质 量 为 $. """ 。 " / 乳 球 蛋 白 的 二 级结构包括由 . 个 反 向 平 行 的 " / 折 叠 构 成 的 疏 水 中 心［ $" ］。 本实验选用了上述 根 据 ! / 乳 白 蛋 白 和 " / 乳 球 蛋 白 结 构， E%(0"M1) 8 . 色谱柱。本文采用 8 . 柱分 离， 目标物出峰时间 短， 峰形尖锐而且对称， 分离度较好， 可以 满 足 " / 乳 球 蛋 白 和 ! / 乳白蛋白的分析要求。 * * 采用 45/6578 分析蛋白的流动相系统基 本 为 三 氟 乙 酸 的水溶液和乙腈 溶 液， 采 用 梯 度 洗 脱， 但随着样品的不同及 色谱柱的不同， 梯度洗脱条件也 随 之 改 变。 在 多 肽 及 蛋 白 质 的反相液相色谱分离中， 初始洗脱条 件 下 流 动 相 中 有 机 溶 剂 的浓度较低， 多肽 及 蛋 白 质 与 固 定 相 间 的 疏 水 作 用 较 强， 多 肽及蛋白质几乎 完 全 被 固 定 相 吸 附。 而 一 旦 流 动 相 中 的 有 机溶剂达到特定的浓度， 使多肽或蛋 白 质 与 固 定 相 的 作 用 小 于与流动相的作用时， 多肽或蛋白质 就 会 完 全 从 固 定 相 上 洗 脱下来， 几乎不再与固定相发生作用［ % ］。这 一 保 留 机 制 也 被 人称为 “ (#/(NN ” 机 制［ $$ ］。 正 是 由 于 多 肽 和 蛋 白 质 的 这 种 特 殊的保留机制， 流动相组成的极微小 的 改 变 就 会 大 大 影 响 多 肽和蛋白质的保留行为， 从而影响疏 水 特 征 相 近 的 多 肽 或 蛋 白质的分离［ $! ］。本文尝试了以不 同 比 例 的 三 氟 乙 酸 的 水 溶 液和乙腈溶液作流动相。当以高 比 例 的 水 进 行 梯 度 洗 脱 时， 多肽及蛋白质的出峰时间延迟； 而以 高 比 例 的 乙 腈 进 行 梯 度 洗脱时， 多 肽 及 蛋 白 质 的 出 峰 时 间 缩 短， 但 !/ 乳 白 蛋 白 和 "/ 乳球蛋白不能分开。在兼顾保留时 间 和 分 离 度 的 前 提 下， 最
表 ! " $ 种乳清蛋白样品信息 编号 $ ! + ) % * 名称 J58." J58+) J58.""" J58.!"" J58+%"+ * 产地 美国 美国 新西兰 新西兰 爱尔兰 标注蛋白质含量 K @ 0 ." 0 +) 0 ." 0 .! 0 +%
* * 采用凯氏定氮法测定各样品中 的 蛋 白 质 含 量； 烘箱恒重 法测定各样品中的水分含量。 * * 分别精确称取 % 个样 品 各 $" * """ 0; ， 用去离子水定容 至 $" 07 。 * * 精确称取 " / 乳球蛋白标准 品 $" 0; ， 用去离子水定容至
参考文献：
［"］ ! 管斌，林洪，王广策 " 食品蛋白 质 化 学 " 北 京：化 学 工 业 出 版 社，$**+ ：#*# 图 # " 样品的高效液相色谱图 " " ! ! 乳白蛋白 （ "&’ (-( #$% ） ；$ " " ! 乳球蛋白 （ "+’ (,* #$% ） " ［$］ ! .$%’)/0% 1 2 ， 1/00$3 4 + ， 567803/% 9 * ， :7780 , ;" < 4)0/#67/’0 = ，"))+ ，,** ：""" ［#］ ! 郭本恒 " 乳品化学 " 北京：中国轻工业出版社，$**" ：$&( ［&］ ! ;%6 < 2 ，>6% ?808378$@% ; 4 A ，*/BB8% = < 5 2 ，+C)#$D7 , 表 #" 两种乳清蛋白的线性方程、 相关系数及检测限 乳清蛋白 线性范围 & （ #’ & ( ） 回归方程 $$ * " )))* " ))-& 检出限 & （ #’ & ( ） （ ! " # % $） # "* 9" < E//D +C$ ，"))+ ，(* （"） ："*& ［+］ ! 朱晓囡，苏志国 " 分析化学，$**& ，#$ （$） ：$&［(］ ! 280C$80 = ，96F7)$80 + E ，EG$33 H" H%7 ,6$0I < ，$**& ，"& （#） ： ",+ ［,］ ! 2/76 2 ， E8008$06 H ， :G$>8$06 2 ， */C)6 4 ， J8$K8$06 < = ， J/0083 , ，9/%C6G>83 2 5" < ($L 4)0/#67/’0 *8G J8C)%/G ， $**& ，$, （ "( ） ：$ ($+ ［-］ ! 2$DDG87/% 1 ，*8$D < * ，4//GB860 J ，<8G8% 5" H%7 ,6$0I < ， $**# ，"# （,） ：+(+ ［)］ ! +)60#6 * ，M6N/06 2 ，O>$37 . ?" H%7 ,6$0I < ， $**$ ， "$ （ "$ ） ： "**+ ［ "* ］ ! .%FD38% < 4 ，:778 < ，:G38% . ，+N$B378D ( A" H%7 ,6$0I < ， $**$ ，"$ （ "* ） ：,)" ［ "" ］ ! +C)GF780 A" 50/78$% ($LF$D 4)0/#67/’06P)I" 18Q R/0N ： ;G38>$80 +C$8%C8 ，"))) ：$$# ［ "$ ］ ! =’F$G60 2 H ，A860% J S" 287)/D3 ;%TI#/G ，"))( ，$,* ：#
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反相高效液相色谱法测定乳清蛋白中的 !/ 乳白蛋白和 " / 乳球蛋白
李 * 慧， * 陈 * 敏， * 李 * 赫， * 罗永康， * 戴蕴青
已经被越来越多地应用于食品工业， 市场上已经出现了许多 不同种类和品牌 的 乳 清 蛋 白 粉 保 健 品， 如 儿 童 营 养 蛋 白 粉、 婴儿配方奶粉等。但乳清蛋 白 又 是 一 种 常 见 的 过 敏 原， "/ 乳 球蛋白是最主要 的 过 敏 原， 其 次 为 ! / 乳 白 蛋 白［ ) ］。 因 此， 通 过蛋白质改性的方 法 已 经 开 发 出 了 低 过 敏 或 无 过 敏 的 乳 清 蛋白质制品。反相 高 效 液 相 色 谱 法 （ 45/6578 ） 是分析乳清 蛋白成分的有效方法之一， 与其他色 谱 方 法 相 比 具 有 分 辨 率 和回收率高、 重复性好、 操作简便等优势［ % ］。 目 前， 45/6578 分析乳清蛋白在国外已经进 行 了 一 定 的 研 究［ & / - ］， 但国内尚 未见有关的研究 报 道。 本 文 采 用 8 . 色 谱 柱， 优 化 了 !/ 乳 白 蛋白和 " / 乳球蛋白的分析条件， 与现有的方法 相 比 缩 短 了 分 析时间， 建立的定量测定两种蛋白质 的 方 法 为 监 测 目 前 市 场 中各类乳清蛋白粉 保 健 品 及 低 过 敏 乳 制 品 的 质 量 提 供 了 有 效的方法。
（ 中国农业大学食品科学与营养工程学院，北京 $""".+ ） 关键词： 反相高效液相色谱 （ 45/6578 ） ； （ ! /)"39"):$01# ） ； （ " /)"39(;)(:$)1# ） ； 乳清蛋白 （ <2-& =%(9-1# ） ! / 乳白蛋白 " / 乳球蛋白 中图分类号： >&%. * * 文献标识码： ? * * 文章编号： $""" /.#$+ （ !""# ） "$ /"$$& /"! * * 栏目类别： 技术与应用
!" 实验部分
! ! !" 仪器与试剂 * * A5B/C$" D’5 高 效 液 相 色 谱 仪， 配二极管阵列检测器 （ 日本岛津 公 司 ） ； EF7/$"$" 控 温 消 煮 炉； EBG/-.!" 凯 式 定 氮仪 （ 北京市通润源 机 电 技 术 有 限 公 司 ） ； 真 空 干 燥 箱 BHI/ &"!" （ 上海精宏实验设备有限公司） 。 * * " / 乳 球 蛋 白 标 准 品、 色谱纯乙腈 ! / 乳 白 蛋 白 标 准 品、 （ A1;0" 公司） ； 三氟乙酸 （ ,ID ） 试剂为国产分析纯。 ! ! #" 样品及对照品溶液的制备 * * % 种乳清浓缩蛋白粉 （ J58 ） 样品的标注信息见表 $ 。
! ! 平 行 取# 份 乳 清 蛋 白 粉" 号 样 品 ， 分别加入一定量的标 准品混 合 溶 液， 用 *’ $$ ! # 的 针 式 滤 器 过 滤 后 进 样 测 定， 结 果见表 # 。
表 $ " 回收率测定结果 （ ’ % #） 乳清蛋白 ! ! 乳白蛋白 " ! 乳球蛋白 本底值 & !’ $, " , ,- " ) 添加值 & !’ "#( #& $$+ )* 检测值 & !’ "+& " ( (* " $ $)$ " " "($ " * 回收率 & )# " # )+ " ( )& " , )$ " # *+, & *" + "" & #" ) $" -
# ! %" 实际样品测定 ! ! 测定了 + 个样品中的蛋白质 及 水 分 含 量， 通过外标法测 得乳清蛋白浓缩粉干 基 样 品 中 ! ! 乳 白 蛋 白 和 " ! 乳 球 蛋 白 的 含量及在样品蛋白质中所占的比例， 结果见表 & 。
图 ! " !! 乳白蛋白和 " ! 乳球蛋白标样的色谱图 " " ! ! 乳白蛋白 （ "&’ ()* #$% ） ；$ " " ! 乳球蛋白 （ "+’ ,*# #$% ） " 样品号 " $ # & + 表 % " 样品定量分析 蛋白质 含量 ,$ " $) " + ,* " & ," " & #& " , 水分 含量 (" " &" * ," & (" ( (" ! ! 乳白蛋白 干基 含量 "" " + &" * )" & )" $ +" # 在蛋白质 中的比例 "& " ) "# " * "$ " & "$ " * "# " & " ! 乳球蛋白 干基 含量 #& " ) "+ " " #- " * #( " "- " 在蛋白质 中的比例 &+ " " &) " # +* " * &- " " &, " -
* * 乳清蛋白是牛奶中的一种主要 蛋 白 质， "/ 乳 球 蛋 白 和 !/ 乳白蛋白是其主要成分， 分别占其总量的 )" @ ’ %" @ 和 $" @
!］ ’ !" @ ［ $ ， 。乳清蛋 白 具 有 较 高 的 营 养 价 值 及 功 能 特 性［ + ］，
质量浓度为 ! ; K 7 ； 同法配 制 ! / 乳 白 蛋 白 标 准 品 质 量 浓 度 为 $1 !. ; K 7 的溶液。上述溶液均作为标准储备液， 保存于 ) L 冰箱中备用。 * * 样品在上样前用孔径为 "1 !! ! 0 的针式滤器过滤。 ! ! %" 色谱条件 * * E%(0"M1) 8 . 色 谱 柱 （ % !0， !%" 00 2 )1 & 00 ） ； 流动 D， "1 $ @ 的 ,ID 水 溶 液； ?， "1 "- @ 的 ,ID 乙 腈 溶 液； 梯 相： 度洗脱程序： 流动相 ? 在 $" 01# 内从 !" @ 上升到 %" @ ， 然后 在 ! 01# 内由 ." @ 降到 !" @ ； 用 $" 01# 从 %" @ 上升到 ." @ ， 流速为 "1 . 07 K 01# ； 二极管阵列检测器， 检测波 长： !$% #0 ； +" L ； 进样量： $" ! 7 。 柱温：
! 第"期
李 ! 慧， 等： 反相高效液相色谱法测定乳清蛋白中的 ! ! 乳白蛋白和 " ! 乳球蛋白
#’ ) - ， 表明该法重现性良好。 # ! $" 回收率
・ "",・
终选择用于测定 ! ! 乳白 蛋 白 和 " ! 乳 球 蛋 白 的 流 动 相 及 梯 度 洗脱条件如 “"" #” 节所述。标准品和样品的分离结 果 分 别 见 图 " 和图 $ 。 ! ! 以 ! " # % $ 测定 ! ! 乳白蛋白 和 " ! 乳 球 蛋 白 最 小 检 出 限， 结果见表 $ 。由表 $ 还 可 看 出， 两组分在测定的浓度范围内 线性关系良好。
收稿日期： !""& (") ($&
第一作者： 李 * 慧， 女， 硕士研究生， 研究方向为天然产物化学， ,-) ： （ "$" ） &!#+#&%" ， ./0"1) ： )12$12-))(!""" , $&+ * 3(0* 通讯联系人： 陈 * 敏， 女， 教授， 研究方向为食品化学， ,-) ： （ "$" ） &!#+#&%" ， ./0"1) ： 01#32-#$- , $&+ * 3(0* 基金项目： 国家自然科学基金资助项目 （ +(* +")#$!!) ） *