银杏叶提取物对大鼠肝硬化的治疗作用及其机制研究

银杏叶提取物对大鼠肝硬化的治疗作用及其机制研究
发表时间：2010-08-20T17:45:18.187Z 来源：《中国医药卫生》杂志2009年第3期供稿作者：高山
[导读] 研究银杏叶提取物（extract of ginkgo biloba，EGb）对大鼠肝硬化的影响并探讨其机制
高山郑州大学第三附属医院药剂科(郑州450052）
【摘要】目的研究银杏叶提取物（extract of ginkgo biloba，EGb）对大鼠肝硬化的影响并探讨其机制。

方法用四氯化碳加高脂饮食法造成大鼠肝硬化模型，银杏叶片以20 mg/kg 、15mg/kg、10m g/kg的量给药30天，测定血清总蛋白（T-P）、白蛋白（ALB）、谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）、总胆红素（TBIL）、血清透明质酸（HA）、层粘蛋白（LN）和Ⅲ型前胶原（PCⅢ）的含量，计算白蛋白与球蛋白的比例（A/G）。

TUNEL测肝细胞凋亡指数。

结果与模型组相比，银杏叶提取物各组能显著降低ALT、AST、TBIL含量，增加白蛋白含量，提高白/球比例，显著降低血清HA、LN和PCⅢ水平；显著降低细胞凋亡指数。

并具有剂量依赖性。

结论银杏叶提取物对大鼠肝硬化具有保护作用，其机制可能是通过抗肝细胞凋亡来实现的。

【关键词】银杏叶提取物肝硬化肝细胞细胞凋亡
［中图分类号］R931.74 ［文献标识码］A ［文章编号］1810－5734(2009)03-0004-03
银杏树叶的提取物（extract of ginkgo biloba，EGb）具有扩张血管，调节血脂，抑制血栓形成；改善记忆；清除自由基等多种药理作用。

临床用于治疗心脑血管方面的疾病和癌症。

已发现银杏叶提取物对肝纤维化、肝癌等具有一定的治疗作用 ［１-6］，临床上已有银杏叶提取物成功用于治疗失代偿期肝硬化的例子，本文主要研究银杏叶提取物——银杏叶片（每片含总黄酮醇苷9.6mg，萜类内脂2.4mg）对大鼠肝硬化的作用，并进行初步的机制探讨。

1 材料与方法
1.1 试验材料：
实验动物：60只SD大鼠，体重180-220g，购自河南省实验动物中心。

动物合格证号：SCXK（豫）2005-0001，动物房温度为
25±2℃，标准大鼠颗粒饲料饲养，自由饮水。

银杏叶片，扬子江药业集团生产，批号08011301。

使用时用0.5%的CMC-Na混悬，配成不同浓度。

1. 2 主要试剂及仪器：
四氯化碳（CCl4）：郑州化学试剂二厂；羧甲基纤维素钠（CMC-Na）：上海浦东化学品有限公司，批号：20071026；透明质酸（HA）、层粘蛋白（LN）、Ⅲ型前胶原（PCⅢ）放免试剂盒均购自北京北方免疫试剂研究所；其它试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。

BT2000全自动生化分析仪，意大利Vialicenza，Roneoo156。

TUNEL 试剂盒, 购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.3 模型制备：
60只大鼠适应性饲养1周，随机分为造模组50只和正常组10只。

采用复合造模方法复制大鼠肝硬化模型 ［７］ ，每周2次皮下注射四氯化碳，0.3ml/100g体重，共10周。

造模开始第1-2周均以20%猪油、0.5%胆固醇、79.5%玉米面混合饲料喂养，第3-9周以0.5%胆固醇和99.5%玉米面混合饲料喂养。

整个造模期间以30%乙醇作为饮料让大鼠自由饮用。

正常组则以正常饲料和纯净水喂养。

造模过程中死亡3只。

实验10周末造模组随机抽取3只经肝组织病理切片确认造模成功后予以分组治疗。

将造模成功的44只大鼠随机分为4组，每组11只，即模型组、EGb 高、中、低剂量组，分别灌胃给予0.5%的CMC-Na及20m g/kg 、15mg/kg、10m g/kg的EGb。

给药30天，给药过程中模型组死亡一只。

给药结束后，大鼠禁食14小时，戊巴比妥钠麻醉，腹主动脉取血后处死动物，取肝脏。

离心分离血清，全自动生化分析仪测定血清总蛋白（T-P）、白蛋白（ALB）、谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）、总胆红素（TBIL）含量，计算白蛋白/球蛋白（A/G）比例；放免法测定血清中HA、LN、PCⅢ含量。

肝细胞凋亡原位检测按照试剂盒说明书操作进行，凡满足下列条件之一者即确定为凋亡肝细胞：（1）出现凋亡小体；（2）核呈新月形；（3）核浓缩。

每张切片选择5个具有代表性的高倍视野（400×），共计数500个肝细胞，取阳性细胞平均百分率作为凋亡指数（Apoptosis index，AI），即：凋亡指数=（5个高倍视野内阳性肝细胞数之和/500）×100%。

1.4 统计学处理：
所有数值以±S，利用SPSS11.0软件进行单因素方差分析、两两比较及相关性分析，p<0.05具有显著性差异，p<0.01具有极显著性差异。

2 结果
2.1 银杏叶片对肝硬化大鼠血清中ALT、AST、TBIL的影响：
肝硬化模型建立后，肝细胞受损，细胞中的酶释放进入血液中，导致血清中ALT、AST含量明显升高；同时，肝功能受损时，胆红素不能与葡萄糖醛酸结合进入胆汁而在血液中蓄积，引起血液中总胆红素水平升高。

经EGb干预后，与模型组相比，银杏叶提取物高中低剂量组可明显降低血清中ALT、AST、TBIL的含量，并呈剂量依赖性。

2.2 银杏叶片对肝硬化大鼠血清中T-P、ALB、A/G的影响
肝硬化大鼠肝脏受损后，合成蛋白质的能力下降，从而导致T-P、ALB的量降低，同时肝细胞损伤时球蛋白生成增加，故A/G显著降低。

经银杏叶提取物干预后，与模型组相比，银杏叶提取物各剂量组可显著升高T-P、ALB和A/G。

2.3 银杏叶提取物对肝纤维化大鼠血清中HA、LN、PCⅢ水平的影响
2.4 对凋亡指数的影响：
正常组肝组织中TUNEL染色阳性肝细胞较少见，多散在分布于中央静脉周围。

模型组可见不同程度的TUNEL染色阳性肝细胞，发生凋亡的肝细胞常位于脂肪变严重以及炎症细胞浸润区域附近，随着脂肪肝程度以及肝细胞炎症、坏死的加重，其肝细胞凋亡指数明显增高。

给予EGb后发现TUNEL染色阳性肝细胞减少，与模型组相比，EGb高、中剂量组肝细胞凋亡指数明显降低。

3 讨论
肝硬化是肝脏慢性反复损伤后肝脏细胞外基质（ECM）合成与降解之间平衡失调、细胞外基质过度沉积的结果。

当肝细胞被破坏、细胞膜通透性增高及线粒体损伤时，AST和ALT被释放到血液中，使之明显升高，酶活性的高低与肝细胞受损的程度相一致；肝细胞受损时，
胆红素不能与葡萄糖醛酸结合进入胆汁而在血液中蓄积，引起血液中总胆红素（TBIL）水平升高。

此外，血清白蛋白主要是由肝细胞合成的，肝功能损害时，血清白蛋白水平下降，而由免疫器官产生的球蛋白量增加。

慢性肝炎和肝硬化患者的白蛋白产生减少，同时球蛋白产生增加，造成A/G比值倒置。

本实验结果显示，银杏叶提取物各剂量组可显著降低肝纤维化大鼠血清AST、ALT水平，提高T-P、ALB含量和A/G比例，表明银杏叶提取物具有保护肝细胞，改善肝功能的作用。

PCⅢ、HA、LN分别是胶原蛋白、蛋白多糖、粘连糖蛋白三种细胞外基质成份的代表。

Gabrielli等［８］认为PCⅢ、HA、LN 三项指标在各型肝炎中随肝脏受损程度而变化，分别在急性肝炎、慢性肝炎和肝硬化之间依次升高。

其升高幅度与肝组织增生程度呈现良好的正相关。

血清PCⅢ反映了肝内胶原代谢的变化［９］，肝脏间质细胞合成HA增加或肝窦内皮细胞摄取HA减少均可引起血清HA升高［１０］，血清LN值被认为是反应基底膜更新率的指标，可反映肝窦毛细血管化和汇管区肝脏受损的范围［１１］。

本试验结果表明，EGb各剂量组可明显降低大鼠血清PCⅢ、HA及LN，提示EGb可减少肝细胞合成HA或增加肝窦内皮细胞摄取HA，降低基底膜的更新率，抑制肝硬化的发展。

由此表明EGb具有保护肝细胞、抑制肝硬化发展的作用。

研究发现肝细胞凋亡参与了多种急慢性肝脏疾病的发生、发展过程，如病毒性肝炎、酒精性肝病、非酒精性脂肪肝、胆汁淤积性肝病及缺血一再灌注损伤等等，是肝细胞损伤的重要机制之一［１２-17］。

体外及体内试验发现二甲基亚硝胺、放线菌酮、硫代乙酰胺等常见的肝毒性药物，均可诱导肝细胞发生凋亡［１８］。

近年［１9］等研究发现，给鼠喂饲四氯化碳产生的经典肝损伤动物模型，运用流式细胞仪、透射电镜、电泳及原位末端标记等技术均检测到这种动物模型肝损伤的肝脏存在细胞凋亡。

研究还发现，病毒性肝炎肝损伤时，凋亡与坏死同时存在，或凋亡的发生早于坏死［20］ 临床各期酒精性肝病患者活检标本均发现有肝细胞凋亡。

因此，肝细胞凋亡在肝脏疾病发病机制中具有重要作用，抑制肝细胞的凋亡有助于延缓慢性肝病的发生和发展。

本试验研究发现，肝硬化大鼠经口服给予EGb后，能降低肝细胞凋亡率，抑制肝细胞的凋亡，抑制肝硬化的发展。

综上所述，银杏叶提取物可改善肝功能，有效抑制肝硬化的发展，其机制可能是通过抗肝细胞凋亡作用来发挥的。

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