植物组织中丙二醛含量的测定

实验六逆境下植物细胞膜脂过氧化产物TBARS的提取与含量测定活性氧(reactive oxygen species，ROS)是机体在生化反应中产生的性质活泼的具有极

强的氧化功能、可以导致机体衰老的物质。

自由基的形成有生化、化学、物理等多方面的因素，但主要是来自机体内的生化反应，如各种酶的催化反应等都可以产生大量自由基。此外，一些化学物质空气污染、辐射、运动和心理压力等都会激发活性氧和自由基的产生。机体在氧的利用过程中，会因各种内因性和外因性因素而产生各种活性氧和自由基，这些自由基在维持机体正常代谢中起到积极的作用。

生物体内的自由基主要包括超氧阴离子(O2-)、羟自由基(·OH)、氢自由基(H·)、有机自由基(R·)、单线态氧(1O2)、过氧化氢(H202)、臭氧(O3)及脂类过氧化自由基(LOO·)和脂类自由基(L·)等。

为维持机体的正常功能，抵御各种活性氧和自由基对器官和组织的伤害，体内有各种清除活性氧和自由基的抗氧化物质，如抗氧化酶类、蛋白质类和抗氧化维生素等。抗氧化酶类主要包括超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢(CA T)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH—Px)、谷

胱甘肽转移酶(GRT)等，这些酶是机体内部的第一道防线，但会随着年龄的增长而下降；蛋白质类包括铁传递蛋白、肝球蛋白、血红素结合蛋白等；抗氧化维生素有维生素C、尿酸、a-VE，α-胡萝卜素，β-胡萝卜素。

当活性氧和自由基浓度超过生理限度时，多余的自由基成为有害物质，攻击脂质、蛋白质、糖类和脱氧核糖核酸等大分子物质，发生各种氧化反应，引发各种氧化损伤，进而导致细胞结构和功能的变化，使机体抵抗力下降，从而导致各种疾病发生，如人体癌症、动脉硬化、心脑血管疾病、肝肾损伤、糖尿病、缺血再灌流障碍等多种疾病。氧化是导致疾病的主要原因之一。如植物受到高温、水渍、低温等不良环境时，从形态上也表现出一系列症状，如萎嫣，叶片变黄，生物量变小等，以及保护酶活性下降等。为了了解生物体的健康状况，有必要对膜脂过氧化产物MDA进行测定。

一、实验目的

1.重点掌握MDA测定的原理和测定方法。

2.了解丙二醛（ MDA ）在生物体形成的因素。

3.进一步熟悉和掌握分光光度计和离心机的使用方法和注意事项。

二、原理

植物器官在衰老或逆境条件下，生物膜中的不饱和脂肪酸与自由基发生过氧化反应，使膜中不饱和脂肪酸含量降低，导致膜的流动性下降，透性增大，使膜的正常功能遭到破坏。

膜脂过氧化分解的终产物之一是丙二醛（malondialdehyde MDA ），MDA是膜脂过氧化作用的最终分解产物，其含量可以反映膜脂过氧化的程度，而且其在生物体内积累还会对膜和细胞造成进一步的伤害，所以MDA的含量可以反映生物体衰老和遭受逆境伤害的程度。

测定原理：丙二醛在酸性和高温条件，可以与硫代巴比妥酸（TBA ）反应生成红棕色的三甲川（3,5,5 —三甲基恶唑2,4- 二酮），在532 nm 处有最大光吸收，在600 nm 处有最小光吸收，据此可测定MDA。可溶性糖干扰该反应，糖与TBA的反应产物在532 nm 处也有吸收，但最大吸收波长在450 nm，为了消除糖类物质对MDA-TBA 反应的干扰，可用下列公式消除由糖类引起的误差。

C (μmol/L ) = 6.45 ( A 532 －A 600 )－0.56A 450

式中：A 450 、A 532 和A 600 分别表示450 nm 、532 nm 和600 nm 处的吸光度值。算出植物样品提取液中MDA 的浓度后，可进一步算出其在植物组织中的含量。

三、实验材料、试剂与仪器设备

（一）实验材料

植物的根或叶片，校园里3种柏科植物爬地柏、侧柏、圆柏。

（二）试剂

1. 10% 三氯乙酸（TCA ）。

2. 0.5% 硫代巴比妥酸（TBA ）溶液：称取硫代巴比妥酸0.5g 溶于10 ％TCA 溶解并用其定容至l00 mL 。

（三）仪器设备

研钵，恒温水浴锅，分光光度计，离心机，天平，刻度试管，移液管

四、实验步骤

1. MDA 的提取与显色

称取植物材料0.2g-0.5（根据材料的受伤害程度），剪碎，加入2 mL 10% TCA 和少量石英砂，研磨至匀浆，再加3mL TCA 进一步研磨，匀浆转移至试管中，加入5mL的TBA 将试管放入沸水浴中煮沸10 min（自试管内溶液中出现小气泡开始计时），取出试管并冷却，3000 r/min 离心15 min ，取上清液并量其体积。

2.以不加样品为对照 0.6 ％ TBA 溶液为空白测定 532 nm 、600 nm 和450 nm 处的吸光度值。

五、结果计算

MDA 含量 ( μmol/g)=1000

/m ⨯⨯）样品重量（）提取液体积（）浓度（g ml L ol MDA μ 注意事项：

1. 0.1-0.5%的三氯乙酸对MDA-TBA 的反应较合适，若高于此浓度，其反应液的非专一性

吸收偏高。

2. MDA-TBA 的反应的加热时间，沸水浴控制在10~15min 。时间太长或太短均会引起

532nm 的吸光度下降。

作业

1. 比较你测定的植物在不同的环境条件（或不同植物在同一逆境下），植物组织中MDA 含量，并分析其原因？

2. 测定MD A 含量有何意义？

3. 简述植物组织中MD A 含量测定的原理？并说明哪些因素干扰MD A 含量测定，应如何消除。

4.让学生阅读两篇参考文献

赵世杰； 许长成； 邹琦； 孟庆伟。植物组织中丙二醛测定方法的改进。植物生理学通讯.1994

陈贵； 胡文玉； 谢甫绨； 张立军. 提取植物体内MDA 的溶剂及MDA 作为衰老指标的探讨. 植物生理学通讯.1991.

陈贵; 张立军. 植物体内MDA 含量单位与计算方法的一些问题. 植物生理学通讯.1991.

参考文献

李丽，刘春明主编.中药抗氧化成分的现代分离和分析技术.科学出版社,2011.05.

李玲, 李娘辉, 蒋素梅等主编. 植物生理学模块实验指导，科学出版社，2009.

李彩霞

2013.11.12编写 2014.10.25修改