激动剂作用下α1-肾上腺素受体亚型在HEK293A细胞中的分布变化

将 HEK293A 细胞用含 10% FBS 的 DMEM，37℃，5% CO2 培养，当细胞达 60% ~70% 融合时，更换无血清的 DMEM 培养液，用脂 质体转染法将分别含有人全长 α1A-、α1B- 和 α1D-AR cDNA 的重组质粒(N末端带有编码Flag标签的DNA 片段)加至细胞培养皿中。24 h 后换新鲜的含 10% FBS 的 DMEM，同时加入800 µg/ml geneticin (G418) 抗生素进行筛选；从抗 G418 的细胞中挑取单个克 隆接种到另外的培养皿中，并继续在含 200 µg/ml G418 的 DMEM 中培养，得到分别稳定表达 α1A-、 α1B- 和 α1D-AR 的细胞株。 1.2 放射配体结合实验检测三种亚型 α1-AR 的表 达 稳定表达三种亚型 α1-AR 的细胞生长至 80% ~90% 融合时，用 10 ml PBS (20 mmol/L Na2HPO4、 154 mmol/L NaCl，pH 7.6)收取细胞，4℃，3 000 g 离心 10 min, 弃上清，加入 20 ml PBS，匀浆，4℃， 20 000 g 离心 10 min，弃上清，加入适量 PBS 混匀， 制成细胞粗制膜标本，冰浴中保存备用。采用氯胺 T法将 Na125I 标记到 α1-AR 选择性拮抗剂 BE2254 上。 在100 µl粗制膜中加入不同浓度125I-BE2254 (12~360 pmol/L)，加或不加 10 µmol/L 酚妥拉明至终体积 250 µl，37°C 温浴 20 min，用 10 mmol/L 冷 Tris-HCl 缓冲液(pH 7.4) 7 ml 终止反应，经玻璃纤维滤膜(上 海红光纸厂，49 型)抽滤，再用 7 ml 冷 Tris-HCl 冲 洗两次，抽干滤膜。用 γ- 计数器测定滤膜的放射 活性值，得出 125I-BE2254 结合饱和曲线，通过非 线性回归和 Scatchard 分析，求出三种亚型 α1-AR 的 最大结合容量(Bmax)和解离常数 Kd 值。 1.3 荧光共聚焦成像分析观察三种亚型 α1-AR 在 HEK293A 细胞中的分布 将瞬时表达三种亚型 α1-AR/GFP的HEK293A细胞有血清培养24 h后换成 无血清的培养液，24 h 后在共聚焦显微镜下分别观 察并摄制未加激动剂和用 PE 刺激 1 h 的细胞内受体 的分布状况。
王淑一等: 激动剂作用下 α - 肾上腺素受体亚型在 HEK293A 细胞中的分布变化 1
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α1- 肾上腺素受体(α1-adrenergic receptor, α1-AR) 是G蛋白耦联受体(G-protein coupled receptor, GPCR) 家族中的一员，在调节心血管的生理活动和病理改 变过程中起着重要的作用[1]。α1- AR 分为三种亚 型，即 α1A-、α1B- 和 α1D-AR。虽然它们都能激活 Gq-PLC-IP3 和 DAG 信号转导通路，但三者介导的效 应却各不相同。这固然与它们可能拥有各自的尚不 为人知的其它 G 蛋白信号通路甚或非 G 蛋白调节途 径有关，但同时值得重视的是，α1-AR 三种亚型功 能受体分布的差异，特别是它们在激动剂作用下不 同的反应和行为特点，可能是造成其功能差异的原 因之一。
Abstract: To investigate the subcellular distribution of three α1-adrenergic receptor subtypes and their internalization and trafficking upon agonist stimulation in human embryonic kidney (HEK) 293A cell line, saturation radioligand binding assay, laser confocal imaging, and Western blot were applied to examine the distribution and changes in localization of three α1-AR subtypes in transfected HEK 293A cells prior to and after treatment with phenylephrine. The results are as follows: (1) The transfection efficiency was over 90% and was equal among three α1-AR subtypes. α1B-AR expression in cell membrane was the highest, and α1D-AR was the lowest, as determined by 125I-BE2254 binding assay, however, Kds were not significantly different among the three receptor subtypes. (2) Without agonist stimulation, α1A-AR was detected not only on the cell surface but also in the cytosol, α1B-AR was predominantly located on the cell surface, whereas α1D-AR was mostly detected in the cytosol. (3) After 1 h of stimulation with phenylephrine, as observed using confocal microscope, less α1A- and α1B-AR were detected on the cell surface but more in the cytosol. The change was more remarkable in α1BAR than that in α1A-AR, whereas no change of distribution was detected in α1D-AR in response to phenylephrine. However, when examined by Western blot, no change in distribution was detected in α1A- and α1D-AR, only α1B-AR showed the same change as that shown in confocal imaging. It is suggested that the characteristics of localization and changes of distribution are different among three α1-AR subtypes in HEK293A cells upon phenylephrine stimulation.
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生理学报 Acta Physiologica Sinica, August 25, 2005, 57 (4): 480-485

研究论文
激动剂作用下 α1- 肾上腺素受体亚型在 HEK293A 细胞中的 分布变化
王淑一 **，宋 峣 **，徐 明，郝天袍，韩启德，张幼怡 *
Key words: α1-adrenergic receptor; distribution; localization; cell line
Received 2004-12-03 Accepted 2005-02-21 This work was supported by the National Basic Research Priorities Programme of China (No. G2000056906) and the National Natural Science Foundation of China (No. 30171083). *Corresponding author. Tel: +86-10-82802306; Fax: +86-10-82802306; E-mail: zhangyy@ **Contributed equally to this work.
WANG Shu-Yi**, SONG Yao**, XU Ming, HAO Tian-Pao, HAN Qi-De, ZHANG You-Yi*
Institute of Vascular Medicine, Peking University Third Hospital and Key Laboratory of Molecular Cardiovascular Sciences, Ministry of Education, Beijing 100083, China
研究表明，当激动剂持续刺激受体时，受体的 生物反应强度会逐渐减弱，亦即发生“减敏”，主 要是由于受体内陷所致。在 α1-AR 三种亚型当中， 目前仅对 α1B-AR 的减敏研究较多，已有报道激动剂 可以引起 α1B-AR 的磷酸化和内陷，参与受体内陷的 氨基酸也已确认[2,3]。然而对 α1A- 和 α1D-AR 的减敏 和下调研究尚很少。由于这些研究多是针对某一受 体亚型，在不同的细胞体系中进行的，而在同一细 胞体系比较 α1-AR 亚型在激动剂作用下分布变化的 研究尚未见报道。为此，本工作采用放射配体结合 分析、荧光共聚焦方法和 Western blot 系统比较 α1AR 三种亚型在 HEK293A 细胞中的分布特点，观察 在激动剂作用下三种亚型受体分布变化的差别。
关 键 词 ：α 1 - 肾上腺素受体；分布；定位；细胞株 中图分类 号：Q 4 6 3
Redistribution of three α1-adrenergic receptor subtypes in the stably transfected HEK 293A cells upon agonist stimulation
1 材料与方法
酚妥拉明(phentolamine)，苯肾上腺素(phenylephrine, PE)，Anti-Flag 抗体(mouse)购自 Sigma 公 司。Anti-mouse IgG 购自 Sa nta Cruz 公司。 Lipofecta-mineTM 2000 试剂盒购自 Invitrogen 公司。 1.1 表达三种亚型 α1-AR 的 HEK293A 细胞株的建立 1.1.1 瞬时表达三种亚型 α1-AR/GFP 的 HEK293A 细胞株的建立 将 HEK293A 细胞接种在带有玻 璃盖玻片的小培养皿中，用含 10% FBS 的 DMEM， 37°C，5% CO2 培养，当细胞达 60%~70% 融合时， 更换无血清的 DMEM培养液，用脂质体转染法将分 别含有人全长 α1A-、α1B- 和 α1D-AR cDNA 的重组 质粒[N 末端带有编码 green fluorescent protein (GFP) 的 DNA 片段]加至细胞培养皿中，37°C，5% CO2 培养 24 h 后，换成含 10% FBS 的 DMEM 继续培养， 待用。 1.1.2 稳定表达三种亚型 α1-AR/Flag 的 HEK293A
北京大学第三医院血管医学研究所，分子心血管学教育部重点实验室，北京 100083
摘 要：为了明确 α1- 肾上腺素受体(α1-adrenergic receptor, α1-AR)三种亚型在人胚胎肾(human embryonic kidney, HEK) 293A 细胞株中的分布特点，及其在激动剂作用下在细胞内的定位改变，本研究采用放射配体结合实验、实时荧光共聚焦成像 和 Western blot 方法检测 α1-AR 三种亚型在细胞中的定位及蛋白质表达的变化。结果发现：(1) α1-AR 三种亚型在 HEK293A 细胞株转染效率相同，均达 90% 以上。三株细胞的粗制膜上 α1B-AR 表达量最高，α1D-AR 最低，α1A-AR 居中，但三者 的解离常数(Kd)相等；(2)在无激动剂作用时，α1A-AR 均匀地分布在 HEK293A 细胞的胞膜和胞浆，α1B-AR 主要位于胞膜， 而 α1D-AR 则主要分布在胞浆中；(3)用 α1-AR 激动剂苯肾上腺素(phenylephrine, PE)刺激细胞 1 h 后，α1A- 和 α1B-AR 在胞膜 上分布明显减少，而在胞浆中分布增加，其中 α1B-AR 变化更为显著，α1D-AR 的分布在 PE 作用下无明显变化。以上结果 提示，在激动剂作用下，α1-AR 三种亚型在 HEK293A 细胞中的定位特点和分布变化各有不同。