微生物检验实验室菌种保存程序

微生物检验实验室菌种保存程序

1．目的

规范菌种保存程序。

2．范围

微生物实验室保存的标准菌种和来自临床的标本菌株。

3．职责

微生物实验室检验人员正确执行本程序。

4．程序

4.1需氧菌保存法

4.1.1一般保存法见表6-1

表6-1 常见菌种培养基保存期限

菌种培养时间培养基保存温

度保存时间

流感嗜血杆菌18-24 脱纤维羊血或脱脂牛奶-20 6个月葡萄球菌、链球菌18-24 血琼脂斜面（高层加液体石蜡）

4—8 1—3年

肠杆菌科18-24 Soxbean酪蛋白琼脂（高层加液

体石蜡）4—8 1年

肠杆菌科、非发酵菌、葡萄球菌等18-24 牛肉汤（6份苛养菌18-24 5%小牛血清肉汤-20 6个月

分枝杆菌18-24 罗氏培养基（加液体石蜡）4—8 3个月幽门螺杆菌18-24 心脑浸液或布氏肉汤加入甘油-70 6年注：保存郡主均需培养18~24h。

4.1.2 冷冻干燥法将待保存菌培养18~24小时后，挑取

菌落加入一定量的牛肉汤或心脑浸出液加入20%的蔗糖，混

匀，分装于安瓿中，置-70℃低温冰箱中迅速冻结，再放入冷

冻干燥机内，抽真空16~24小时，然后将安瓿封口，置低温

冰箱保存。大多数菌株可保存10年以上，甚至更长。

4.1.3 超冰冻法保存菌株初代培养18~24小时的菌落、

菌苔，加入0.5~1.0ml无菌脱纤维羊血安瓿中，封口，置液

氮或-40℃冰箱中保存。

4.2 厌氧菌保存法

4.2.1短期保存方法

4.2.1.1疱肉培养基保存法用牛肉渣和牛肉浸出液制成

疱肉培养管，接种待保存菌株，然后覆盖1~2cm的石蜡，再

将培养管垂直放置片刻，待石蜡凝固置35℃培养（无芽胞厌

氧菌培养72小时，普通梭菌培养24小时，产气荚膜梭菌和

多枝梭菌培养2周左右），最后置室温或-20℃保存。发酵糖

类的厌氧菌每个月转钟1次，不发酵糖类的厌氧菌3~6个月

转钟1次。

4.2.1.2 半固体培养基保存法在上述液体培养基中加

入.0.2%~0.5%琼脂，制成半固体培养基，接种时用毛细管将待保存的厌氧菌的菌液加入半固体培养管底，表面加入1~2cm厚度的液体石蜡，密封管口，培养48小时，置室温或-20℃保存。

4.2.1.3 甘油乳剂培养基保存法在厌氧液体培养基（含胰蛋白胨、牛肉膏、酵母浸液、L-半胱氨酸和维生素K等）中加入少量牛肉渣分装于长试管中，接种待保存菌株，置35℃培养48~72小时，取出后加入无菌甘油（按1:1比例），盖紧盖子后用石蜡封口，置4℃或-20℃保存。此法适用于保存脆弱拟杆菌、产黑色素普雷沃菌和具核梭杆菌。

4.2.2 长期保存法

4.2.2.1 低温冷冻保存法（厌氧菌在低温条件下新陈代谢处于抑制状态，不繁殖也不死亡）培养基包括脱纤维羊血、兔血或马血，20%脱脂牛乳，7.5%葡萄糖的马血清。将待保存菌株（培养24~48小时）加入上述培养基中，封好瓶口，置-70℃液氮或-70℃低温冰箱中保存。菌种不同造成保存时间差异，最长可保存10年，最短可保存2年以上。

4.2.2.2 冷冻真空干燥法冷冻真空干燥法的培养基（保存剂）有两种，一种是用10%~20%脱脂牛奶加入0.1%的谷氨酸钠和0.03%的L-半胱氨酸，煮沸15分钟消毒，冷却备用。另一种是用10%蔗糖与马血清的混合液，过滤灭菌，并置厌

氧环境中预还原，分装备用。将培养48小时左右（处于生长静止期）的厌氧菌落或菌苔刮下，加入一定量的上述培养基，混匀分装于安瓿中，置-20℃低温冰箱中迅速冻结，再放入冷冻干燥机内，抽真空16~24小时，然后将安瓿封口，置4℃环境下长期保存。

4.3 结核分枝杆菌保存法

4.3.1 短期保存方法（悬浮液低温保存法）结核分枝杆菌充分悬浮于经高压灭菌的20%丙三醇-生理盐水中，保藏在-20℃。使用该方法，大部分分枝杆菌能保存1年以上。

4.3.2 长期保存方法（悬浮液超低保存法）10mg结核分枝杆菌充分悬浮于冻存溶液（6g胰蛋白胨溶于100ml20%丙三醇水溶液）中，保藏温度-70℃。使用该方法，大部分分枝杆菌能保存5年以上。

4.4真菌菌种保存法

4.4.1 冰冻保存法冰冻保存有助于抑制真菌，尤其是抑制皮肤癣菌发生多形性变化，即变异（当其培养物变成白色蓬松绒毛状时，真菌就失去所有特征性的颜色及形态学特征，甚至会停止产生各种孢子，由此会导致菌种鉴定困难）。真菌接种在沙氏培养基上培养8~10日或直至见到菌落将近要全面覆盖培养基时，将试管置于-20℃冰箱中保存。

4.4.2 石蜡油保存法真菌接种于沙氏琼脂上，25℃培

养，酵母菌2~4日，产孢子的丝状真菌需形成成熟的孢子，不产孢子的真菌生长成健壮的菌丝为止。覆盖2cm的无菌石蜡（矿物）油（石蜡油的灭菌一般在1小时以上，然后将自然冷却的石蜡油加入含真菌的试管中，使液面高于斜面顶部1cm左右）。使用此方法，许多真菌可在室温下存活数年。

在恢复培养时，先从石蜡油下面挑取一小块（2~3mm3）菌落，沿试管壁边挑取边挤压过多的石蜡油（因石蜡油过多会抑制真菌生长），然后接种于沙氏琼脂斜面上，培养数日并观察生长情况。

4.4.3 水保存法将真菌接种于培养基的斜面上，待培养成熟后，将无菌蒸馏水直接注入试管中，冲洗下孢子和菌丝，简便易行，经济，效果好。在恢复培养时，取混悬液接种于SDA培养基中即可。大多数真菌均可用这种方法保存数年（最长12年）。