酸性染料比色法测定玛咖总生物碱含量的方法研究_卢馨

酸性染料比色法测定玛咖总生物碱含量的方法研究
卢馨1，刘文虎1，曾里1，黄张君2，易彬2，曾凡骏1*
1. 四川大学食品科学与工程系（成都 610065）；
2. 泸州老窖集团养生酒业有限责任公司（泸州 646000）
摘要以苦参碱为对照品, 采用酸性染料比色法测定玛咖总生物碱的含量, 研究并建立玛咖总生物碱的测定方法。

对检测方法使用的最大吸收波长、缓冲液pH、缓冲液用量、0.05%溴甲酚绿显色剂用量、溶液振摇时间、氯仿萃取时间进行了优化研究。

结果显示, 此方法精密度RSD=0.95%, 回收率为108.03%, RSD=0.79%, 表明该方法具有较好的精密度和稳定性; 且操作简单, 具有良好的可重复性。

此方法测得云南丽江玛咖总生物碱含量为0.7%, 苦参碱最低检测限为0.86 μg。

关键词酸性染料比色法; 玛咖; 总生物碱
Determination of Total Alkaloids in Maca by Acid Dye Colorimetry Lu Xin1, Liu Wen-hu1, Zeng Li1, Huang Zhang-jun2, Yi Bin2, Zeng Fan-jun1*
1. Department of Food Science, Sichuan University (Chengdu 610065);
2. Luzhou Laojiao Group Health Wine Industry Co., Ltd. (Luzhou 646000)
Abstract With the matrine as reference, establish a method for the determination of total alkaloids in Maca by acid dye colorimetry, and research and establish the determination methods of total alkaloids in Maca. The detection method of the maximum absorption wavelength, buffer pH, the dosage of buffer solution, 0.05% of bromocresol green coloration agent dosage, solution of shaking time, chloroform extraction time were studied. The results showed that the RSD=0.95% of precision, the recovery was 108.03%, RSD=0.79%, showed that the method had good precision and stability; And the operation is simple, with good repeatability. This method measured the content of alkaloids was 0.7% of Maca, the lowest detection limit of matrine was 0.86 μg.
Keywords acid dye colorimetry; Maca; total alkaloids
玛咖（Lepidium meyenii Walp），十字花科独行菜，属一年生或2年生草本植物，原产于秘鲁安第斯山区[1]，其块根可以药食兼用，具有悠久历史，近十多年来更逐渐成为开发的热点之一。

生物碱是含负氧化态氮原子的环状化合物[2]，广泛存在于生物有机体中。

适量的总生物碱对人体具有镇痛、消炎、降压、抑菌、抗氧化及抗癌等多种生理活性[3]，因此研究玛咖中总生物碱的测定方法具有非常重要的意义。

总生物碱含量定量分析方法常用方法有滴定法和酸性染料比色法、薄层扫描法、高效液相色谱法、毛细管电泳法和气相色谱法等[4]。

本研究对玛咖总生物碱的酸性染料比色法进行了研究和探索。

1 材料与方法
1.1 材料与设备
原料与试剂：玛咖粉：产地为云南丽江，由丽江百岁坊生物科技开发有限公司提供；95%乙醇；2%HCl；1mol/L NaOH溶液；pH 3.6盐酸-邻苯二甲酸氢钾缓冲溶液；0.05%溴甲酚绿指示液（溴甲酚绿显色剂）；苦参碱标品溶液：8.6 mg/100 mL；氯仿；蒸馏水。

主要仪器：DSY-1-4 型电热恒温水浴锅：北京爱琦霞商贸中心；AR2130 型电子天平：奥豪斯Adver-turerTM；UV-1100 型紫外-可见光分光光度计：上海美谱达仪器有限公司；低速离心机：LD5-2B 型最大转速5 000 r/min：北京雷博尔离心机有限公司；PHS-3C 型精密pH计：上海雷磁仪器厂；KQ-100DE 型数控超声波清洗器：昆山市超声仪器有限公司；125 ml 分液漏斗、三角瓶、漏斗、容量瓶、比色管、蒸发皿等。

1.2 试验方法
1.2.1 玛咖总生物碱提取液的制备
取玛咖粉末5.0 g于250 mL三角烧瓶中，加入200 mL 95%乙醇，置于功率为100 W的超声波清洗器中，温度60 ℃下超声提取40 min，过滤，残渣重复提取2次，合并滤液，浓缩得浸膏。

10 mL 2%的HCl溶解，过滤，残渣用10 mL 2% HCl洗涤2次，合并滤液。

用浓氨水调节滤液pH 2~3，等体积氯仿萃取3次。

将酸提取液用5 mol/L NaOH调节pH 9~10，等体积氯仿萃取3次。

合并萃取液，蒸发浓缩至10 mL，即得玛咖总生物碱的供试品溶液。

1.2.2 苦参碱对照品溶液的配置
取苦参碱对照品8.6 mg，精密称量，溶于氯仿溶液中，并定容至100 mL，得到质量浓度为8.6 mg/100 mL的对照品溶液。

1.2.3 溴甲酚绿显色剂的制备
*
通讯作者
241
按中国药典配制，取溴甲酚绿0.1 g，加0.05 mol/L NaOH溶液2.8 mL使溶解，再加水稀释至200 mL即得，在pH 3.6~5.2区间内，颜色变化范围为：黄色~蓝色。

1.2.4 酸性染料比色法试验条件的确定
1.2.4.1 酸性染料比色法最大吸收波长扫描
精密吸取供试品及苦参碱对照品溶液各1.0 mL，置于25 mL 比色管中。

依次加入氯仿5.0 mL、0.05%溴甲酚绿显色剂2.0 mL、pH 4.00缓冲溶液5.0 mL，密塞振摇1 min，倒入125 mL分液漏斗中，静置1 h，取氯仿层，在氯仿层中加入无水硫酸钠0.200 g，摇匀，放置10 min。

采用全波长扫描方法，在300~700 nm波长范围内进行扫描。

1.2.4.2 缓冲液pH的选择
精密吸取样品溶液1.0 mL，加入氯仿5.0 mL，分别加入pH 2.0，2.5，3.0，3.6，4.0，4.8的盐酸-邻苯二甲酸氢钾缓冲液或氢氧化钠-邻苯二甲酸氢钾缓冲液5 mL 及配0.05%溴甲酚绿溶液2.0 mL，密塞振摇1 min，倒入125 mL分液漏斗中，静置1 h，取氯仿层，在氯仿层中加入无水硫酸钠0.200 g，摇匀，放置10 min，于最大吸收波长处测吸光度。

1.2.4.3 缓冲液用量的选择
精密吸取样品溶液1.0 mL，加入氯仿5.0 mL，分别加入pH 3.6的盐酸-邻苯二甲酸氢钾缓冲液 3 mL，4 mL，5 mL，6 mL，7 mL，8 mL及0.05%溴甲酚绿溶液2.0 mL，密塞振摇1 min，倒入125 mL分液漏斗中，静置1 h，取氯仿层，在氯仿层中加入无水硫酸钠0.200 g，摇匀，放置10 min，于最大吸收波长处测吸光度。

1.2.4.4 0.05%溴甲酚绿显色剂用量的选择
精密吸取样品溶液1.0 mL，加入氯仿5.0 mL，加入pH 3.6的盐酸-邻苯二甲酸氢钾缓冲液4 mL及0.05%溴甲酚绿显色剂2 mL，3 mL，4 mL，5 mL，6 mL，7 mL，密塞振摇1 min，倒入125 mL分液漏斗中，静置1 h，取氯仿层，在氯仿层中加入无水硫酸钠0.200 g，摇匀，放置10 min，于最大吸收波长处测吸光度。

1.2.4.5 溶液振摇时间的选择
精密吸取样品溶液1.0 mL，加入氯仿5.0 mL，加入pH 3.6的盐酸-邻苯二甲酸氢钾缓冲液4 mL及0.05%溴甲酚绿显色剂5 mL，密塞振摇0.5 min，1 min，1.5 min，2.0 min，2.5 min，3.0 min，倒入125 mL分液漏斗中，静置1 h，取氯仿层，在氯仿层中加入无水硫酸钠0.200 g，摇匀，放置10 min，于做大吸收波长处测吸光度。

1.2.4.6 氯仿萃取时间的选择
精密吸取样品溶液1.0 mL，加入氯仿5.0 mL，加入pH 3.6的盐酸-邻苯二甲酸氢钾缓冲液4 mL及0.05%溴甲酚绿显色剂5 mL，密塞振摇1 min，倒入125 mL分液漏斗中，静置0.5 h，1 h，1.5 h，2 h，2.5 h，取氯仿层，在氯仿层中加入无水硫酸钠0.200 g，摇匀，放置10 min，于最大吸收波长处测吸光度。

1.2.5 标准曲线的绘制
准确吸取苦参碱对照品溶液0.0 mL，0.2 mL，0.4 mL，0.6 mL，0.8 mL，1.0 mL，氯仿定容至1.0 mL。

依次加入氯仿5 mL、pH 3.6的盐酸-邻苯二甲酸氢钾缓冲液4 mL、0.05%溴甲酚绿显色剂5 mL，密塞振1 min，倒入125 mL分液漏斗中，静置1 h，使水层和氯仿层分清后，在分出的氯仿层加入无水硫酸钠0.200 g，在414 nm波长处测定吸光度。

以测得的吸光度为纵坐标，生物碱含量为横坐标，作标准曲线，得出线性回归方程。

1.2.6 精密度试验
取同一比色样品，采用同样方法连续测定6次，记录吸光度。

1.2.7 稳定性试验
采用加样回收法，精密吸取4份测试样品0.4 mL，分别加入苦参碱对照品0.3 mL，0.4 mL，0.5 mL，0.6 mL，按照标准曲线项下规定的方法测定，记录吸光度。

2 结果与分析
2.1 酸性染料比色法测定条件的确定
2.1.1 酸性染料比色法最大吸收波长的确定
根据1.2.4.1的试验方法确定最大吸收波长，试验结果如图1所示。

结果表明，供试品在408 nm~414 nm 处有最大吸收峰，苦参碱对照品在412 nm~420 nm处
有最大吸收峰，故选414 nm为其检测波长。

图1 苦参碱对照品和样品显色后波长扫描
2.1.2 缓冲液pH的确定
根据1.2.4.2的试验方法确定缓冲液pH，试验结果如图2所示。

结果表明，供试品在pH 3.5~3.6处有最大吸收峰，因pH 3.6的盐酸-邻苯二甲酸氢钾缓冲溶液有配置方法，因此选pH 3.6为缓冲溶液的pH。

2.1.3 缓冲液用量的确定
根据1.2.4.3的试验方法确定缓冲液用量，试验结果如图3所示。

结果表明，供试品在缓冲液用量为4 mL处有最大吸收峰，因此选缓冲液的用量为4 mL。

2.1.4
0.05%溴甲酚绿显色剂用量的确定
242
243
根据1.2.4.4的试验方法确定0.05%溴甲酚绿显色剂的用量，试验结果如图4所示。

结果表明，供试品在显色剂用量为5 mL处有最大
吸收峰，因此选显色剂用量为5 mL。

图2 不同缓冲溶液pH对玛咖总生物碱提取率的影响
图3 不同缓冲液用量对玛咖总生物碱提取率的影响
图4 不同显色剂用量对玛咖总生物碱提取率的影响2.1.5 溶液振摇时间的确定
根据1.2.4.5的试验方法确定溶液的振摇时间，试验结果如图5所示。

结果表明，供试品在振摇时间为1 min时具有最大
吸光度，所以选择振摇时间为1 min。

图5 不同振摇时间对玛咖总生物碱提取率的影响2.1.6 氯仿萃取时间的确定
根据1.2.4.6的试验方法确定氯仿萃取时间，试验结果如图6所示。

结果表明，供试品在萃取时间为1~2
h时的吸光度无明显差异，所以选择萃取时间为1 h。

图6 不同萃取时间对玛咖总生物碱提取率的影响2.2 苦参碱标准曲线
经过试验数据处理，得出标准曲线为Y =13.724x -
0.007 5，相关系数为0.999 8（参见图7）。

图7 苦参碱标准曲线
2.3 精密度试验
取同一比色样品，采用同样方法连续测定6次，吸光度测定见表1。

计算RSD值为0.95%，表明仪器精密度符合要求。

表1 精密度试验测定结果
编号样品量/mL
吸光度1 1.00.1922 1.00.1903 1.00.1944 1.00.1905
1.00.1946
1.0
0.193
2.4 稳定性试验
采用加样回收法，精密吸取6份测试样品0.4 mL，分别加入苦参碱对照品0.3 mL，0.4 mL，0.5 mL，0.6 mL，0.7 mL，0.8 mL，按照标准曲线项下规定的方法测定，结果（参见表2）表明，其平均回收率为108.03%，RSD为0.79%，n =6。

表2 稳定性试验测定结果
编号样品量/ mL 样品生物碱含量/ mg 对照品加样量/mL 对照品生物碱含量/mg 测得总生物碱吸光度测得总生物碱含量/ mg 回收率
/ %
10.40.005 80.20.017 20.3290.024 5108.718 62
0.40.005 80.30.025 80.4590.034 0109.269 630.40.005 80.40.034 40.5770.042 6106.946 640.40.005 80.50.043 00.7060.052 0107.416 850.40.005 80.60.051 60.8350.061 4107.730 26
0.4
0.005 8
0.7
0.060 2
0.965
0.070 9
108.075 2
244
3 结论与讨论
经试验研究，得出了测定总生物碱含量的最优方法：精密吸取样品溶液1.0 mL，加入氯仿5.0 mL，加入pH 3.6的盐酸-邻苯二甲酸氢钾缓冲液4 mL及0.05%溴甲酚绿显色剂5 mL，密塞振摇1 min，倒入125 mL分液漏斗中，静置1 h，取氯仿层，在氯仿层中加入无水硫酸钠0.200 g，摇匀，放置 10 min，于414 nm处测吸光度，测得云南丽江玛咖总生物碱含量为0.7%，该方法苦参碱的最低检测线为0.86 μg，此结果与罗堾子[5]检测的玛咖总生物碱含量接近。

与其他方法相比[6-7]，此方法具有较好的精密度、稳定性；且操作简单，具有良好的可重复性。

荧光法快速测定鸡血清中恩诺沙星的残留量席会平1,2*，刘彦钊2
1.武汉理工大学资源与环境学院（武汉 430070）；
2. 河南质量工程职业学院（平顶山 467000）
摘要建立鸡血清中恩诺沙星残留量的快速测定方法: 荧光光度法。

用甲醇沉淀蛋白对血清进行预处理, 利用
SDS-Mg 2+- ENRX体系, 鸡血清中恩诺沙星浓度在1.00~3.00 μg・mL -1范围时, 荧光强度与浓度呈线性关系, 其回归方程为F =37.580 15+14.261 37C (μg・mL -1)(r =0.999 0), 血清中恩诺沙星的平均回收率为97.76%, RSD=1.1%。

所用方法简便、准确、快速, 可用于鸡血清中恩诺沙星的测定。

关键词
荧光分光光度法; 恩诺沙星; 血清; 残留量
Rapid Determination of Enrofloxacin Residues in Chicken Serum by Fluorescence
Spectrometry
Xi Hui-ping 1, 2*, Liu Yan-zhao 2
1.School of Resource and Environmental Engineering, Wuhan University of Technology (Wuhan 430070);
2. Henan Quality Polytechnic (Pingding Shan 467000)
Abstract To establish a method for quantitative determination of enro fl
oxacin in serum of chicken. enro fl oxacin was determined by fl uorescence spectrophotometry. Methyl alcohol was used to remove protein in the serum, In SDS-Mg 2+
- ENRX system, The linear range was 1.00~3.00 μg·mL -1 and regression equation is F =37.580 15+14.261 37C (μg·mL -1)(r =0.999 0). The average recovery of enro fl oxacin was 98.07% with RSD of 1.13%. This method is simple, accurate, rapid and can be used to determine enro fl oxacin in serum of chicken.
Keywords fl
uorescence spectrometry; enro fl oxacin; serum; residues 恩诺沙星（enrofloxacin，ENRX）为第三代氟喹
诺酮类广谱抗菌药，具有抗菌谱广、杀菌活性强、毒副作用小，与其他抗菌药无交叉耐药性和敏感微生物的MIC较低等优点，被广泛应用于各种动物感染性疾病的预防和治疗[1]，是动物专用的氟喹诺酮类药物。

少量使用可促进动物生长，但过量使用或使用不当会导致畜产品中药物残留。

由于其耐药性和潜在的致癌性，欧盟、日本及我国均制定了在组织中的最高残留限量为100 μg・L -1。

恩诺沙星其含量测定方法已收载于《中国兽药典》2000年版一部[2]，目前文献报道的测定药物制剂中恩诺沙星含量的方法主要有高效液相色谱法[3]、流动注射-化学发光法[4]、荧光法[5]和原子吸收法[6]。

HPLC法已经成功地应用于动物血清中的药物残留分析[3-7]，但样品前处理和色谱条件复杂、操作烦琐、费时。

根据恩诺沙星的荧光特性，贾丽华等[5]采用荧光光度法测定了恩诺沙星药物的含量，但鸡血清中
参考文献：
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