血清乳酸脱氢酶测定

临床意义
LDH虽广泛存在于人体的各组织中。存在于几乎所有组织中， 以肝、肾、心肌、骨骼肌、胰腺和肺中为最多。这些组织中的 LDH的活力比血清中高1000倍。所以当少量组织坏死时，该酶即 释放血而使其血液中的活力升高。测定此酶常用于对心梗、肝 病和某些恶性肿瘤的辅助诊断。心脏以LDHl为主;而横纹肌以及 肝脏、血小板以LDH5为主;肺、脾以LDH3为主，脑、肠、淋巴与 内分泌腺也含有LDH 3。由于LDH同工酶分布有明显的组织特异 性，故可根据这一特异性来协助诊断疾病。成年健康人 LDH2>LDHl>LDH3> LDH4>LDH5或LDH2>LDH3>LDHl>LDH4>LDH5。
单位定义
以100ml标本作用15min生成1μg分子丙酮酸为1单位。
参考值
血清100-300U/L
注意事项
1.
2.
3.
4.
LDH只作用于L－乳酸钠，只用L－乳酸钠用量减办； 草酸盐抑止LDH活力，不能用草酸钾作为抗凝剂的抗凝血 来测定； 不能用溶血标本； 比色应该在5-15min内完成，否则A降低。
蒸馏水
2、4-二硝基苯肼 0.4mol/L NaOH
0.15
0.5 5
0.15
0.5 5
0.15
0.5 5
0.15
0.5 5
Байду номын сангаас
0.15
0.5 5
0.15
0.5 5
0.15
0.5 5
37℃水浴15min
相对应LDH单位
0
125
250
500
750
1000
1250
混匀，440nm比色，以空白管调0,读取各管A，以A对LDH单位作图，绘 制标准曲线。
底物（乳酸）、PMS 和 NBT，同工酶区带即呈蓝紫色。
二、操作步骤
1、制备0.5%琼脂糖凝胶板；
2、上样12-15μl；
3、120V、90min电泳；
4、显色与保温；
注：显色剂应临时配制并避光保存，保温也应避光进行。
-
点样孔(样品端接 负极)
LDH5 1.4% LDH4 LDH3 LDH 2 3.9% 18.5% 42.8%
量少肉眼观察不到
LDH1 33.4%
溴酚蓝电泳 指示剂
+
血清LDH活性的测定
原理
丙酮酸在碱性条件下和2、4-二硝基苯肼反应生成 的2、4-二硝基苯腙在碱性条件下呈棕色，颜色的深浅 和丙酮酸浓度成正比。然后与丙酮酸标准液比较，可 求得LDH活性单位。
操作

标准曲线的绘制
试剂（ml） 丙酮酸标准液 乳酸钠缓冲液 空白 － 0.5 1 .025 .475 2 0.05 0.45 3 0.1 0.4 4 0.15 0.35 5 0.2 0.3 6 0.25 0.25
•血清LDH活性的测定
试剂（ml） 血清（1:5稀释） 乳酸钠缓冲液 37℃水浴3min NAD＋ 蒸馏水 37℃水浴15min 2、4-二硝基苯肼 0.4mol/L NaOH 0.5 0.5 5 0.1 0.1 测定管 对照管
0.05
0.5
0.05
0.5
37℃水浴15min
5 混匀，室温5min后440nm比色，以蒸馏水调0,读取两管A。以测定 管A－对照管A的差值查标准曲线，求出LDH的活力单位.
0-5 30-8 40-97
5.7±2.9
（ 占总 LDH活性的百分比）
a
2
1
2
b
3 1 4 酶活性 5 酶活性 3 4 5
迁移位置 (a)
迁移位置
LDH同工酶电泳图谱
(b)
（a）正常人LDH同工酶电泳图谱 （b）心肌梗塞病人血清LDH同工酶电泳图谱
*生理及临床意义
在代谢调节上起 着重要的作用； 酶 用于解释发育过 活 程中阶段特有的代谢 性 特征； 同工酶谱的改变 有助于对疾病的诊断； 同工酶可以作为 遗传标志，用于遗传 分析研究。
EXPERIMENT 6
血清乳酸脱氢酶测定
实验目的

学习血清LDH同工酶的测定 学习血清LDH活性的测定
实验原理
来源于同一个体或组织，能催化同一反应，而蛋白 结构不同的酶称为同工酶(isoenzyme) 。同工酶的蛋白 结构、理化性质乃至免疫学性质不同的一组酶。因此可 用电泳或其它方法将它们分离开。
血清LDH同工酶的测定

乳酸脱氢酶（LDH）同工酶，它们都能催化乳酸脱氢产 生丙酮酸，经电泳分离后有5个同工酶区带。LDH由2类 亚基组成，单个亚基MW为35000,总分子量为140000。
H H H H LDH1 (H4) H H H M LDH2 (H3M) H H M M LDH3 (H2M2) H M M M LDH4 (HM3) M M M M LDH5 (M4)
乳酸脱氢酶的同工酶
人体心、肝和骨骼肌LDH同工酶谱
组织器官
心 肝 骨骼肌 正常血清
LDH1
35-70 0-8 1-10
27.1±2.8
LDH2
28-45 2-10 4-18 34.7±4.3
LDH3
2-16 3-33 8-38
20.9±2.4
LDH4
0-6 6-27 9-36
11.7±3.3
LDH5
(1)正常LDHl、LDH2见于心肌损伤，如心肌梗塞、心脏手术、心脏移 植排异、充血性心衰、心肌炎。心梗病人出现症状后12一18小时血 清LDH升高，约在第3天达到高峰，7一18天才恢复正常。故对诊断发 病后数天才就医的病人特别有价值。LDHl>LDH2还见于肾梗塞、肾病， 巨幼细胞性贫血、溶血性贫血、恶性贫血。 (2)恶性肿瘤以LDH3增高为主，LDH3明显大于LDHl，总LDH越高预后 越差。LDH2和LDH3增高见于肺癌、粒细胞白血病，LDH3和LDH4增高 见于淋巴瘤、胶原病和止血紊乱 (血小板增多症、凝血活酶释放)。 (3) LDH5增高见于骨骼肌损伤和肝胆疾病，如杜氏肌营养不良、横 纹肌溶解症、肌肉外伤，LDH5>LDH4见于肝损伤 (肝炎、肝硬化、肝 癌、心衰、肝淤血)，阻塞性黄疸时LDH 4与LDH5均增高，但以LDH4 最为明显。
1
2 3
心肌梗死酶谱
正常酶谱
肝病酶谱
4
5
心肌梗死和肝病病人血清LDH同工酶谱的变化
CH3 H OH COOH
H 3C
+
NAD+
LDH
O COOH
+ NADH•H+
NADH•H++ PMS•H2 +
PMS NBT
NAD+ + PMS
PMS•H 蓝色化合物
2
+ NBT•H2
当 LDH 同工酶区带在琼脂糖凝胶板上分开后，给NAD+,