基因重组方法=全

由噬菌体介导的细菌细胞间进行遗传交换的一种方式:
一个细胞的DNA通过病毒载体的感染转移到另一个细胞中
能将一个细菌宿主的部分染色体或质粒DNA 带到另一个细菌的噬菌体称为转导噬菌体
细菌转导的二种类型:
普遍性转导 局限性转导
(1)普遍性转导( transduction) (1)普遍性转导(generalized transduction) 普遍性转导
通过滤板再度感染LA-22 通过滤板再度感染LALA
重组后得到原养型(his+,try+) 重组后得到原养型(his+,try+)的转导子
鼠伤寒沙门氏菌的普遍性转导
噬菌体的DNA包装酶酶也能识别染色体DNA上类似pac的位点 噬菌体的DNA包装酶酶也能识别染色体DNA上类似pac的位点 DNA包装酶酶也能识别染色体DNA上类似pac 转导噬菌体为什么" 转导噬菌体为什么"错 并进行切割, headful"的包装机制包装进P22噬菌体外壳 的包装机制包装进P22噬菌体外壳, 并进行切割,以"headful 的包装机制包装进P22噬菌体外壳, " 形成只含宿主DNA DNA的转导噬菌体颗粒 假噬菌体) 形成只含宿主DNA的转导噬菌体颗粒(假噬菌体). 将宿主的DNA包裹进去? DNA包裹进去 将宿主的DNA包裹进去?
(2) 机制
(大肠杆菌的接合机制) 大肠杆菌的接合机制)
接合作用是由一种被称为F 接合作用是由一种被称为F因子的质粒介导 F因子的分子量通常为5×107,上面有编码细菌产生性菌毛 因子的分子量通常为5 (sex pili)及控制接合过程进行的20多个基因. pili)及控制接合过程进行的20多个基因. 20多个基因
把供体菌的少数特定基因转移到受体菌中
温和噬菌体λ裂解时的 不正常切割:包含gal或bio基因
(几率一般仅有10-6)
缺陷噬菌体在宿主细胞内能够象正常的λDNA分子一样进行复制, 包装,提供所需要的裂解功能,形成转导颗粒. 但没有正常噬菌体的溶源性和增殖能力,感染受体细胞后,通过 DNA整合进宿主染色体而形成稳定的转导子.
b)局限性转导颗粒携带特定的染色体片段并将固定的个别基因 导入受体,故称为局限性转导. 导入受体,故称为局限性转导.而普遍性转导携带的宿主基 因具有随机性. 因具有随机性.
溶源转变( conversion): 溶源转变(lysogenic conversion):
一个与转导相似又不同的现象 温和噬菌体感染细胞后使之发生溶源化, 温和噬菌体感染细胞后使之发生溶源化,因噬菌体的基因 整合到宿主染色体上,而使后者获得了新性状的现象. 整合到宿主染色体上,而使后者获得了新性状的现象.
(1).实验证据
1946年,Joshua Lederberg 和Edward L.Taturm 细菌的多重营养缺陷型杂交实验
中间平板上长出的原养型菌落 是两菌株之间发生了遗传交换 和重组所致! 和重组所致!
证实接合过程需要细胞间的直接接触的 "U"型管实验( B源自文库rnard Davis,1950 )
外源DNA被降解,转导失败.
(2)局限性转导( transduction) (2)局限性转导(specialized transduction) 局限性转导
温和噬菌体感染 整合到细菌染色体的特定位点上
宿主细胞发生溶源化
溶源菌因诱导而发生裂解时, 溶源菌因诱导而发生裂解时, 在前噬菌体二侧的少数宿主 基因因偶尔发生的不正常切 割而连在噬菌体DNA上 割而连在噬菌体DNA上 DNA 部分缺陷的温和噬菌体
实验现象 管的右臂放溶源性细菌 LA-22(受体), ),左臂放 LA-22(受体),左臂放 敏感菌LA LA供体) 敏感菌LA-2(供体)
用泵交替抽吸, 用泵交替抽吸,使两 端的液体来回流动
管的中间用烧结玻璃滤板 隔开, 隔开,它只允许液体和比 细菌小的颗粒通过
LA-22端出现了原养型 LA-22端出现了原养型 的个体(his+,try+) 的个体(his+,try+)
d)F′菌株,Hfr菌株内的F因子因不正常切割而脱离染色体时, F′菌株,Hfr菌株内的F因子因不正常切割而脱离染色体时, 菌株 菌株内的 形成游离的但携带一小段染色体基因的F因子,特称为F′ F′因 形成游离的但携带一小段染色体基因的F因子,特称为F′因 细胞表面同样有性菌毛. 子. 细胞表面同样有性菌毛.
3.1 原核生物的基因重组
细菌的三种水平基因转移形式
接合 转导 自然转化
(conjugation): 接合 (conjugation): 细胞与细胞的直接接触( 因子介导) 细胞与细胞的直接接触(由F因子介导) 转导(transduction): 转导(transduction): (transduction) 由噬菌体介导
Hfr菌株内的F因子因不正常切割而脱离染色体时, 形成游离的但携带一小段染色体基因的F因子, 特称为F′因子.
F′×F-与F+×F-的不同:给体的
部分染色体基因随F′一起转入受体细胞
a)与染色体发生重组; b)继续存在于F′因子上, 形成一种部分二倍体;
3.1.2 细菌的转导(transduction)
Hfr菌株仍然保持着F+细胞的特征,具有F性菌毛,并象F+一样与F2)Hfr ×F-杂交 细胞进行接合.所不同的是,当OriT序列被缺刻螺旋酶识别而产生 Hfr菌株的F因子插入到染色体DNA上,因此只要发生接合转移转移 缺口后,F因子的先导区(leading region)结合着染色体DNA向受体细 过程,就可以把部分甚至全部细菌染色体传递给F-细胞并发生重组 胞转移,F因子除先导区以外,其余绝大部分是处于转移染色体的末 ,由此而得名为 . 端,由于转移过程常被中断,因此F因子不易转入受体细胞中,故 Hfr×F-杂交后的受体细胞(或接合子)大多数仍然是F-.
局限性转导与普遍性转导的主要区别: 局限性转导与普遍性转导的主要区别:
a)被转导的基因共价地与噬菌体DNA连接,与噬菌体DNA一起 被转导的基因共价地与噬菌体DNA连接,与噬菌体DNA一起 DNA连接 DNA 进行复制,包装以及被导入受体细胞中. 进行复制,包装以及被导入受体细胞中.而普遍性转导包装的 可能全部是宿主菌的基因. 可能全部是宿主菌的基因.
高频重组菌株
染色体上越靠近F因子的先导区的基因,进入的机会 就越多,在F-中出现重组子的的时间就越早,频率也高.
F因子不易转入受体细胞中,故Hfr×F杂交后的受体细胞(或称接合子)大多 数仍然是F-.
细胞基因的这种转移过程又常称为性导(sexduction),F因子转导 3)F′×F-杂交 (F-duction),或F因子媒介的转导(F-mediated transduction).
溶源转变与转导的不同? 溶源转变与转导的不同?
a)不携带任何供体菌的基因; 不携带任何供体菌的基因; b)这种噬菌体是完整的,而不是缺陷的; 这种噬菌体是完整的,而不是缺陷的;
噬菌体可以转导给体染色体的任何部分到受体细胞中的转导过程
1) 意外的发现
1951年,Joshua Lederberg和Norton Zinder为了证实大肠杆菌以外 Lederberg和 Zinder为了证实大肠杆菌以外 1951年 的其它菌种是否也存在接合作用, 的其它菌种是否也存在接合作用,用二株具不同的多重营养缺陷型 的鼠伤寒沙门氏菌进行类似的实验: 的鼠伤寒沙门氏菌进行类似的实验:
含有F因子的细胞: 雄性"菌株( ),其细胞表面有性菌毛 含有F因子的细胞:"雄性"菌株(F+),其细胞表面有性菌毛 不含F因子的细胞: 雌性"菌株( ),细胞表面没有性菌毛 不含F因子的细胞:"雌性"菌株(F-),细胞表面没有性菌毛
F因子为附加体质粒 既可以脱离染色体在细胞内独立存在,也可插入(整合) 既可以脱离染色体在细胞内独立存在,也可插入(整合)到染色体上
型管进行同样的实验时, 用"U"型管进行同样的实验时,在给体和受体细胞 型管进行同样的实验时 不接触的情况下,同样出现原养型细菌! 不接触的情况下,同样出现原养型细菌!
沙门氏菌LT22A是携带P22噬菌体的溶源性细菌 沙门氏菌LT22A是携带P22噬菌体的溶源性细菌 LT22A是携带P22 另一株是非溶源性细菌
3,基因重组 , 基因重组( recombination) 基因重组(gene recombination)是两个独立基因组内 的遗传基因,通过交换与重新组合形成新的稳定基因组 的过程.
原核微生物基因组 通常只是部分遗传物质的转移和重
组,并且通过转化,接合和转导等形式进行; 并且通过转化,接合和转导等形式进行; 发生在有性繁殖过程中, 真核微生物的基因重组 发生在有性繁殖过程中,通过 减数分裂后整套染色体发生高频率交换(基因重组) 减数分裂后整套染色体发生高频率交换(基因重组) 在真核微生物中的部分真菌存在不通过减数分裂而在有 丝分裂过程产生低频率基因重组的准性生殖方式
1) F+×F-杂交
菌株的F因子向F 细胞转移,但含F F+菌株的F因子向F-细胞转移,但含F因子的宿主细胞 的染色体DNA一般不被转移. 的染色体DNA一般不被转移. DNA一般不被转移
杂交的结果:给体细胞和受体细胞均成为F 杂交的结果:给体细胞和受体细胞均成为F+细胞
理化因子的处理可将F因子消除而使F 菌株变成F 理化因子的处理可将F因子消除而使F+菌株变成F-菌株
DNA不能复制,因此群体中仅一个细胞含有DNA, 普遍性转导的三种后果: 而其它细胞只能得到其基因产物,形成微小菌落.
特点:在选择培养基平板上形成微小菌落
转导DNA不能进行重组和复制,但其 携带的基因可经过转录而得到表达.
流产转导(abortive transduction) 进入受体的外源DNA通过与细胞染色体 的重组交换而形成稳定的转导子
溶源性菌株LA溶源性菌株LA-22 中少数细胞在培养 LA 过程中自发释放出温和型噬菌体P22 过程中自发释放出温和型噬菌体P22
通过滤板感染另一端的敏感菌株LA通过滤板感染另一端的敏感菌株LA-2 LA LA- 裂解后,产生大量的" LA-2裂解后,产生大量的"可滤过因子 ",其中极少数在成熟过程中包裹了 LADNA片段 片段( try+基因 基因) LA-2的DNA片段(含try+基因)
因为染色体上的pac与P22 DNA的pac序列不完全相同, 因为染色体上的pac与 DNA的pac序列不完全相同, pac 序列不完全相同 利用效率较低,这种"错装"机率一般仅约10 利用效率较低,这种"错装"机率一般仅约10-6-10-8
普遍性转导的基本要求: 普遍性转导的基本要求:
形成转导颗粒的噬菌体可以是温和的也可以是烈性的,但必须 形成转导颗粒的噬菌体可以是温和的也可以是烈性的, 具有能偶尔识别宿主DNA的包装机制并在宿主基因组完全降解 具有能偶尔识别宿主DNA的包装机制并在宿主基因组完全降解 DNA 以前进行包装. 以前进行包装.
自然遗传转化(natural transformation): 自然遗传转化(natural genetic transformation): 游离DNA分子 游离DNA分子 + 感受态细胞 DNA
3.1.1细菌的接合作用(conjugation) (参见 P 215) 通过细胞与细胞的直接接触而产生的 遗传信息的转移和重组过程
F因子的四种细胞形式
菌株, 不含F因子,没有性菌毛, a)F-菌株, 不含F因子,没有性菌毛,但可以通过 接合作用接收 因子而变成雄性菌株( F因子而变成雄性菌株(F+);
b)F+菌株, F因子独立存在,细胞表面有性菌毛. 菌株, 因子独立存在,细胞表面有性菌毛.
c)Hfr菌株,F因子插入到染色体DNA上,细胞表面有性菌毛. Hfr菌株, 因子插入到染色体DNA上 细胞表面有性菌毛. 菌株 DNA
基因的传递很可能是由可透过" 型管滤板 基因的传递很可能是由可透过"U"型管滤板 的 P22噬菌体介导的 P22噬菌体介导的
一个表面看起来的常规研究却导致 一个惊奇和十分重要发现的重要例证! 一个惊奇和十分重要发现的重要例证!
(普遍性转导这一重要的基因转移途径的发现) 普遍性转导这一重要的基因转移途径的发现)