基因工程菌培养
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基因工程菌培养
一、概述 基因工程菌生产的产品主要有二类，蛋白 质和非蛋白质。 基因操作： 敲除或插入基因片段、增强 启动子— —代谢工程 基因插入载体，转化工程菌
1
非蛋白质产物大多可以通过代谢工程，改 造细胞的一些基因，如在细胞中插入编码 酶的DNA，产生新的途径或增强某一途径， 从而得到新的化合物或增加产量。
30
3、诱导时间对外源蛋白表达的影响 诱导时间：加入诱导剂后的培养时间
随着诱导时间的延长，外源蛋白的表达量增加， 但外源蛋白在细胞内的积累，对重组菌产生毒 性，合成速率下降，甚至产物被分解。
诱导时间对酶表达水平和活力的影响 诱导时间 酶活力 酶表达水平 0 0.02 1 52.3 37% 2 118.8 57% 3 120.8 67% 4 165.0 68% 5 139.9 64% *L-天冬酰氨酶
25
3、恒溶氧流加
用复膜氧电极来控制补糖。当培养液的氧饱 和百分数高于控制点，糖阀开启，以一定速 率补糖。加入的糖被菌利用则需要更多的氧， 从而降低溶氧浓度，引起读数下降。当读数 下降到控制点以下，糖阀关闭，需氧就会随 之减少，溶氧逐渐上升，从而达到供需平衡。 Konstantinov等进一步发展了这种方法，用 DO-state法间歇流加葡萄糖，通过控制溶氧、 搅拌转速及糖流加速率，使乙酸维持在低浓 度，从而获得高密度和高表达
17
4、生长速率占优势的不稳定性
所有这三种因素的关键是变异了的宿主载体 系统和原宿主-载体系统的生长速率不同。如 果变异了的宿主载体系统比原来的宿主-载体 系统有生长优势，那么变异了的系统将最终 占优势，基因不稳定性就出现。
（四）表达的诱导 基因工程菌的产物表达需要诱导，诱因主要 有：温度诱导、乳糖或乳糖结构类似物诱导、 氧饥饿诱导、葡萄糖饥饿诱导、甲醇诱导等。
6
大肠杆菌作为宿主的主要问题是
大肠杆菌分泌(secretion)的蛋白通常在 细胞内，当这些蛋白达到高浓度时，会被 水解或形成不溶的包含体。包含体中的蛋 白是不折叠的，不折叠的蛋白没有生物活 性，必须重新溶解并使它复性。
大量的外源蛋白的产生会触发热冲击响 应。热冲击调节子的一种响应是增加蛋白 水解酶的活性。在一些情况下，细胞内蛋 白水解酶使蛋白的降解速率几乎等于产生 的速率。
高表达的障碍是： 外源基因的不稳定，造成表达的下降
高生长速率与高表达之间的矛盾
乙酸的产生
蛋白的降解
20
高密度培养的措施
分批补料培养 以分批培养为基础，吸取 了连续培养的优点，可消除高浓度底物对 细胞生长的抑制作用，还可以弥补低浓度 底物限制细胞生长的缺陷，从而有效地控 制了菌体的生长过程。因此，要实现重组 大肠杆菌的高密度培养，最常用和最有效 的方法就是分批流加补料培养法。现在常 用的是反馈补料培养。有几种反馈控制
13
பைடு நூலகம்
在大的反应器中含有非常多的细胞，总会 存在无质粒细胞，例如1000L发酵液，每 毫升有109个细胞，总共就有1015个细胞， 那么在这个反应器中就含有109个无质粒 细胞。 质粒的分离丢失受许多环境因素影响，如 溶氧、温度、培养基组成和恒化器中的稀 释速率。 许多质粒也会形成多聚体，它是相同质粒 附着在一起形成一个单位。
14
分离丢失示意图
15
2、质粒结构不稳定性 除了分离不稳定性问题外，某些细胞保留 质粒，但质粒结构发生改变，而不产生外 源蛋白，减少对细胞的有害影响，这就是 结构不稳定性。如果质粒发生突变，仍保 留了抗生素抗性基因，但不合成外源蛋白， 那么这些突变株仍能在含有抗生素的培养 基中生长。而且由于不合成外源蛋白，生 长得比原来的工程菌更快，使得在这种培 养物中带有突变质粒的菌占统治地位，这 种培养情况就是结构不稳定性。
24
2、恒pH流加 大肠杆菌在LB培养基上生长，pH会上升。 这是由于菌体分解LB培养基中的胰蛋白胨， 造成氨积累的原因。因此用葡萄糖代替酸 液进行恒pH流加。实验通过pH反馈控制 系统流加葡萄糖，使pH恒定，结果推迟了 比生长速率降低的时间，细胞密度是无流 加的2倍。也可以以葡萄糖代替酸液，以氨 水代替氢氧化钠碱液，同时流加氨水和葡 萄糖。这种方法的缺点是葡萄糖浓度往往 不易控制，容易产生乙酸，对某些工程菌 不适宜。
18
四、重组大肠杆菌的培养策略
关键点：高密度、高表达 菌密度的测定：光密度（OD值或A值） 在波长600～660nm 菌生长的障碍是 重组菌携带外源基因，加重代谢负担，生长 缓慢 外源蛋白不能分泌到胞外，在菌体内合成后 就会造成积累。高表达的外源蛋白尤其是高度 疏水性蛋白对菌体有害，对细胞生长有抑制作 用，甚至会导致细胞中毒或死亡, 因此工程菌 的比生长速率往往远小于宿主菌。 19
11
（三）基因不稳定性 生产的目标是得到最大量的外源蛋白，但 是大量外源蛋白的形成对宿主细胞是有损 害的，通常是致死的，失去制造外源蛋白 的能力的细胞一般生长得快得多，从而能 替代有生产能力的菌株，这就导致基因的 不稳定性。 基因的不稳定性原因： 分离丢失 结构不稳定性 宿主细胞调节突变
12
8
3、低等真核细胞
酵母菌 酿酒酵母是第一个被人利用的生物 现在发展了其他的酵母如甲醇营养型酵母等 优点 生长快 最大生长速率是大肠杆菌的25% 个体大 酵母比最大的细菌大，容易从发 酵液中回收。 有简单糖基化能力和分泌蛋白的能力。 缺点 酵母达到高表达水平比大肠杆菌困难， 外源蛋白分泌到胞外也有限。 只能简单糖基化。 当产生的外源蛋白需要复杂的糖基化和翻译 后修饰时，要用动物细胞组织培养来达到。
1、分离丢失
当细胞分裂时一个子细胞没有接受质粒就出 现分离丢失。 为什么会出现质粒丢失呢？ 质粒可分为高拷贝质粒（>20拷贝/细胞）和 低拷贝质粒（有时低到每个细胞一至二个拷 贝）。低拷贝质粒有专门的机制保证在子代 细胞中有相等的分配，高拷贝质粒通常很少 遵循二分法分配到子代细胞。对于高拷贝质 粒，绝大多数子细胞接受一些质粒，也有可 能有的细胞没有接受质粒，出现质粒丢失。 虽然形成无质粒细胞的可能性是低的（每百 万细胞分裂中一个）。
10
三、利用基因工程菌生产的特点 （一）基因工程菌带有外源基因，外源基 因可能在质粒上也可能整合到染色体上， 这些基因可能不稳定。丢失外源基因的菌 往往比未丢失质粒的菌生长快得多，这样 就会大大降低产物的表达。为了抑制基因 丢失的菌的生长，一般在培养中加入选择 压力，如抗生素。 （二）基因工程菌的培养一般分两段。前 期是菌体生长，生长到某一阶段，加入诱 导因子，诱发产物表达。
29
2、pH值对工程菌生长和表达的影响 在相同通气量和搅拌速度下，pH值对不同 菌群生长影响不大，而对外源蛋白表达有 一定影响。由于工程菌培养采用两阶段培 养工艺，前期为菌体生长阶段，后期为蛋 白诱导表达阶段。偏碱性的pH对外源蛋白 的表达不利，因此，表达时要调节pH在 6.8-7.0之间，以保证外源蛋白的高水平表 达。
28
1、溶氧浓度对工程菌发酵的影响
在鲤鱼生长激素基因工程菌的发酵研究中发 现，当发酵液的溶氧为1.8~2.6ppm/L时， 菌体湿重为1.9~2.08g/L外源基因表达量为 13.8%~16.7%，而当溶氧值提高到 4.0ppm/L时菌体湿重为2.27g/L外源基因表 达量为26.4%。在诱导表达期间，要维持外 源基因的高水平转录和翻译，细胞需要大量 的能量代谢以促进呼吸作用。因此通过增大 通气量和提高搅拌转速以保证较大的溶氧值， 不仅提高工程菌的生长而且有利于外源蛋白 产物的形成。
9
4、哺乳动物细胞 哺乳动物细胞在表达时有正确的氨基酸排 列，而且所有转译后处理（修饰）与在整 个动物中相同，在某种情况下可能转译后 修饰有些不同，但它可提供最接近于天然 副本的产物，此外多数产物可以分泌到胞 外。 但动物细胞生长缓慢，培养基价格昂贵， 蛋白表达水平较低。用于重组DNA 生产蛋 白的最常用的宿主是CHO（中国仓鼠卵巢 细胞）。
21
控制基质浓度流加
恒pH流加
恒溶氧流加 控制比生长速率的葡萄糖流加
22
23
1、控制基质浓度流加
用专门的电极维持基质浓度（如葡萄糖、乙 酸、氨等）。以葡萄糖为例，用葡萄糖电极 检测发酵液中的葡萄糖含量，葡萄糖电极通 过反馈系统与补糖单元相连。当葡萄糖浓度 在设定值之上，糖阀关闭；当葡萄糖浓度由 于菌体消耗低于设定值时，糖阀开启，葡萄 糖以一定速率加入。这样，发酵液中的葡萄 糖浓度始终保持恒定，可避免葡萄糖的抑制 效应，达到很高的细胞浓度。
32
诱导时机对酶表达水平和活力的影响 生物量（A600） 酶活力 酶表达水平 0.015 6.0 15.0% 0.034 0.049 19.1 31.1% 0.111 0.160 72.5 41.5% 0.065 0.225 102.6 49.8% 0.07 0.295 165.0 57.7% 0.065 0.360 105.5 53.4% 0.05 0.410 62.4 44.5% 0.04 0.450 30.2 22.5% *L-天冬酰氨酶
4
二、宿主-载体系统 构建基因工程菌，必须选择宿主和表达系统
要求：翻译后的修饰要简单
如果用于食品要考虑宿主菌要求安全， 列入FDA表中 常用的宿主系统有：大肠杆菌 G+细菌 低等真核细胞 哺乳动物细胞
5
1、大肠杆菌 如果产品翻译后不需要修饰，最普遍选用大肠 杆菌作为宿主。 优点： 人们对大肠杆菌的生理学和遗传学背景了解 得比其他任何生物深。有利于进行复杂的基因 操作； 大肠杆菌有相当高的生长速率，并能长到高 细胞浓度（50g/l）； 大肠杆菌能生长在简单的便宜的培养基上。
16
3、宿主细胞突变 宿主细胞的突变也会造成生产能力的下降。 这些突变通常改变细胞调节，结果减少目标 蛋白的合成。例如，控制外源蛋白表达的启 动子，利用宿主细胞的启动子，如果宿主细 胞启动子的改变，将大大改变质粒编码蛋白 的生产水平。乳糖操纵子是常用是操纵子， 通过加入乳糖或它的结构类似物（如IPTG） 来启动表达，如果乳糖操纵子编码半乳糖苷 透酶的基因发生突变就会阻止乳糖或乳糖的 结构类似物进入细胞，从而不能启动细胞的 表达。
26
4、控制比生长速率的葡萄糖流加 菌体的比生长速率与代谢产物的表达 密切相关。比生长速率太大，超过某 一值，易产生乙酸，这一比生长速率 值称为菌体的乙酸产生临界比生长速 率。通过考察得出最优比生长速率， 控制溶氧、转速、补糖来控制比生长 速率。
27
五、生长与表达的影响因素
不同发酵条件下工程菌发酵结果 通气量 搅拌转速 DO pH OD600 诱导时间 菌体湿重 蛋白量 1 1 150 1.8 7.0 0.7 4 1.9 13.8% 2 2 250 2.6 7.8 0.77 4 2.08 16.7% 3 3 500 3.8 7.5 0.74 6 2.10 18.2% 4 3 500 4.0 7.0 0.83 6 2.27 26.4% 5 3 500 3.6 7.0 2.44 6 5.185 8.9% *鲤鱼生长激素基因工程菌
31
4、诱导时机对表达的影响
诱导时机指加入诱导剂的时间
以天冬酰氨酶表达为例，见表。在 A600=0.295*10时生长速度比较快，这时菌 体进入诱导状态，酶蛋白的积累加快，酶 活和表达水平都较高。而菌体进入对数期 后期，由于发酵液中营养的消耗，及代谢 产物的积累，使菌体的生长速度受到抑制。 在此状态下诱导，表达显然受到影响。
蛋白类产物大多是外源基因片段整合到载 体（如质粒）上，然后转入宿主菌，表达 外源蛋白。 现代基因工程发酵的蛋白质产物主要是这 种方法构建重组菌
2
细胞因子、疫苗、酶
3
产品最主要的用于疾病的诊断和治疗， 此外还有用于畜牧业、食品或工业用的生 物催化剂。 产品特点：要求高纯度。如果不纯，病人 可能产生的强的免疫反应或副作用这对人 是灾难性的。 有的蛋白转译后还要进行修饰，如糖基 化、磷酸化后才有活性。 附加值高。治疗蛋白最主要的是保证产 品的质量和安全，降低成本并不重要。
7
2、G+细菌
枯草杆菌是可替代大肠杆菌的菌种，它是 G+菌，它没有外膜，并且能把蛋白分泌 （excretion）到胞外。它的这一性质对生 产非常有吸引力。
枯草杆菌有许多问题妨碍它在商业上的应 用。主要是枯草杆菌产生大量的蛋白酶， 会很快降解产物。而且枯草杆菌基因构建 比大肠杆菌困难，质粒稳定性也比较差， 所以在使用上有较大的限制，
一、概述 基因工程菌生产的产品主要有二类，蛋白 质和非蛋白质。 基因操作： 敲除或插入基因片段、增强 启动子— —代谢工程 基因插入载体，转化工程菌
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非蛋白质产物大多可以通过代谢工程，改 造细胞的一些基因，如在细胞中插入编码 酶的DNA，产生新的途径或增强某一途径， 从而得到新的化合物或增加产量。
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3、诱导时间对外源蛋白表达的影响 诱导时间：加入诱导剂后的培养时间
随着诱导时间的延长，外源蛋白的表达量增加， 但外源蛋白在细胞内的积累，对重组菌产生毒 性，合成速率下降，甚至产物被分解。
诱导时间对酶表达水平和活力的影响 诱导时间 酶活力 酶表达水平 0 0.02 1 52.3 37% 2 118.8 57% 3 120.8 67% 4 165.0 68% 5 139.9 64% *L-天冬酰氨酶
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3、恒溶氧流加
用复膜氧电极来控制补糖。当培养液的氧饱 和百分数高于控制点，糖阀开启，以一定速 率补糖。加入的糖被菌利用则需要更多的氧， 从而降低溶氧浓度，引起读数下降。当读数 下降到控制点以下，糖阀关闭，需氧就会随 之减少，溶氧逐渐上升，从而达到供需平衡。 Konstantinov等进一步发展了这种方法，用 DO-state法间歇流加葡萄糖，通过控制溶氧、 搅拌转速及糖流加速率，使乙酸维持在低浓 度，从而获得高密度和高表达
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4、生长速率占优势的不稳定性
所有这三种因素的关键是变异了的宿主载体 系统和原宿主-载体系统的生长速率不同。如 果变异了的宿主载体系统比原来的宿主-载体 系统有生长优势，那么变异了的系统将最终 占优势，基因不稳定性就出现。
（四）表达的诱导 基因工程菌的产物表达需要诱导，诱因主要 有：温度诱导、乳糖或乳糖结构类似物诱导、 氧饥饿诱导、葡萄糖饥饿诱导、甲醇诱导等。
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大肠杆菌作为宿主的主要问题是
大肠杆菌分泌(secretion)的蛋白通常在 细胞内，当这些蛋白达到高浓度时，会被 水解或形成不溶的包含体。包含体中的蛋 白是不折叠的，不折叠的蛋白没有生物活 性，必须重新溶解并使它复性。
大量的外源蛋白的产生会触发热冲击响 应。热冲击调节子的一种响应是增加蛋白 水解酶的活性。在一些情况下，细胞内蛋 白水解酶使蛋白的降解速率几乎等于产生 的速率。
高表达的障碍是： 外源基因的不稳定，造成表达的下降
高生长速率与高表达之间的矛盾
乙酸的产生
蛋白的降解
20
高密度培养的措施
分批补料培养 以分批培养为基础，吸取 了连续培养的优点，可消除高浓度底物对 细胞生长的抑制作用，还可以弥补低浓度 底物限制细胞生长的缺陷，从而有效地控 制了菌体的生长过程。因此，要实现重组 大肠杆菌的高密度培养，最常用和最有效 的方法就是分批流加补料培养法。现在常 用的是反馈补料培养。有几种反馈控制
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பைடு நூலகம்
在大的反应器中含有非常多的细胞，总会 存在无质粒细胞，例如1000L发酵液，每 毫升有109个细胞，总共就有1015个细胞， 那么在这个反应器中就含有109个无质粒 细胞。 质粒的分离丢失受许多环境因素影响，如 溶氧、温度、培养基组成和恒化器中的稀 释速率。 许多质粒也会形成多聚体，它是相同质粒 附着在一起形成一个单位。
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分离丢失示意图
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2、质粒结构不稳定性 除了分离不稳定性问题外，某些细胞保留 质粒，但质粒结构发生改变，而不产生外 源蛋白，减少对细胞的有害影响，这就是 结构不稳定性。如果质粒发生突变，仍保 留了抗生素抗性基因，但不合成外源蛋白， 那么这些突变株仍能在含有抗生素的培养 基中生长。而且由于不合成外源蛋白，生 长得比原来的工程菌更快，使得在这种培 养物中带有突变质粒的菌占统治地位，这 种培养情况就是结构不稳定性。
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2、恒pH流加 大肠杆菌在LB培养基上生长，pH会上升。 这是由于菌体分解LB培养基中的胰蛋白胨， 造成氨积累的原因。因此用葡萄糖代替酸 液进行恒pH流加。实验通过pH反馈控制 系统流加葡萄糖，使pH恒定，结果推迟了 比生长速率降低的时间，细胞密度是无流 加的2倍。也可以以葡萄糖代替酸液，以氨 水代替氢氧化钠碱液，同时流加氨水和葡 萄糖。这种方法的缺点是葡萄糖浓度往往 不易控制，容易产生乙酸，对某些工程菌 不适宜。
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四、重组大肠杆菌的培养策略
关键点：高密度、高表达 菌密度的测定：光密度（OD值或A值） 在波长600～660nm 菌生长的障碍是 重组菌携带外源基因，加重代谢负担，生长 缓慢 外源蛋白不能分泌到胞外，在菌体内合成后 就会造成积累。高表达的外源蛋白尤其是高度 疏水性蛋白对菌体有害，对细胞生长有抑制作 用，甚至会导致细胞中毒或死亡, 因此工程菌 的比生长速率往往远小于宿主菌。 19
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（三）基因不稳定性 生产的目标是得到最大量的外源蛋白，但 是大量外源蛋白的形成对宿主细胞是有损 害的，通常是致死的，失去制造外源蛋白 的能力的细胞一般生长得快得多，从而能 替代有生产能力的菌株，这就导致基因的 不稳定性。 基因的不稳定性原因： 分离丢失 结构不稳定性 宿主细胞调节突变
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3、低等真核细胞
酵母菌 酿酒酵母是第一个被人利用的生物 现在发展了其他的酵母如甲醇营养型酵母等 优点 生长快 最大生长速率是大肠杆菌的25% 个体大 酵母比最大的细菌大，容易从发 酵液中回收。 有简单糖基化能力和分泌蛋白的能力。 缺点 酵母达到高表达水平比大肠杆菌困难， 外源蛋白分泌到胞外也有限。 只能简单糖基化。 当产生的外源蛋白需要复杂的糖基化和翻译 后修饰时，要用动物细胞组织培养来达到。
1、分离丢失
当细胞分裂时一个子细胞没有接受质粒就出 现分离丢失。 为什么会出现质粒丢失呢？ 质粒可分为高拷贝质粒（>20拷贝/细胞）和 低拷贝质粒（有时低到每个细胞一至二个拷 贝）。低拷贝质粒有专门的机制保证在子代 细胞中有相等的分配，高拷贝质粒通常很少 遵循二分法分配到子代细胞。对于高拷贝质 粒，绝大多数子细胞接受一些质粒，也有可 能有的细胞没有接受质粒，出现质粒丢失。 虽然形成无质粒细胞的可能性是低的（每百 万细胞分裂中一个）。
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三、利用基因工程菌生产的特点 （一）基因工程菌带有外源基因，外源基 因可能在质粒上也可能整合到染色体上， 这些基因可能不稳定。丢失外源基因的菌 往往比未丢失质粒的菌生长快得多，这样 就会大大降低产物的表达。为了抑制基因 丢失的菌的生长，一般在培养中加入选择 压力，如抗生素。 （二）基因工程菌的培养一般分两段。前 期是菌体生长，生长到某一阶段，加入诱 导因子，诱发产物表达。
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2、pH值对工程菌生长和表达的影响 在相同通气量和搅拌速度下，pH值对不同 菌群生长影响不大，而对外源蛋白表达有 一定影响。由于工程菌培养采用两阶段培 养工艺，前期为菌体生长阶段，后期为蛋 白诱导表达阶段。偏碱性的pH对外源蛋白 的表达不利，因此，表达时要调节pH在 6.8-7.0之间，以保证外源蛋白的高水平表 达。
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1、溶氧浓度对工程菌发酵的影响
在鲤鱼生长激素基因工程菌的发酵研究中发 现，当发酵液的溶氧为1.8~2.6ppm/L时， 菌体湿重为1.9~2.08g/L外源基因表达量为 13.8%~16.7%，而当溶氧值提高到 4.0ppm/L时菌体湿重为2.27g/L外源基因表 达量为26.4%。在诱导表达期间，要维持外 源基因的高水平转录和翻译，细胞需要大量 的能量代谢以促进呼吸作用。因此通过增大 通气量和提高搅拌转速以保证较大的溶氧值， 不仅提高工程菌的生长而且有利于外源蛋白 产物的形成。
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4、哺乳动物细胞 哺乳动物细胞在表达时有正确的氨基酸排 列，而且所有转译后处理（修饰）与在整 个动物中相同，在某种情况下可能转译后 修饰有些不同，但它可提供最接近于天然 副本的产物，此外多数产物可以分泌到胞 外。 但动物细胞生长缓慢，培养基价格昂贵， 蛋白表达水平较低。用于重组DNA 生产蛋 白的最常用的宿主是CHO（中国仓鼠卵巢 细胞）。
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控制基质浓度流加
恒pH流加
恒溶氧流加 控制比生长速率的葡萄糖流加
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1、控制基质浓度流加
用专门的电极维持基质浓度（如葡萄糖、乙 酸、氨等）。以葡萄糖为例，用葡萄糖电极 检测发酵液中的葡萄糖含量，葡萄糖电极通 过反馈系统与补糖单元相连。当葡萄糖浓度 在设定值之上，糖阀关闭；当葡萄糖浓度由 于菌体消耗低于设定值时，糖阀开启，葡萄 糖以一定速率加入。这样，发酵液中的葡萄 糖浓度始终保持恒定，可避免葡萄糖的抑制 效应，达到很高的细胞浓度。
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诱导时机对酶表达水平和活力的影响 生物量（A600） 酶活力 酶表达水平 0.015 6.0 15.0% 0.034 0.049 19.1 31.1% 0.111 0.160 72.5 41.5% 0.065 0.225 102.6 49.8% 0.07 0.295 165.0 57.7% 0.065 0.360 105.5 53.4% 0.05 0.410 62.4 44.5% 0.04 0.450 30.2 22.5% *L-天冬酰氨酶
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二、宿主-载体系统 构建基因工程菌，必须选择宿主和表达系统
要求：翻译后的修饰要简单
如果用于食品要考虑宿主菌要求安全， 列入FDA表中 常用的宿主系统有：大肠杆菌 G+细菌 低等真核细胞 哺乳动物细胞
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1、大肠杆菌 如果产品翻译后不需要修饰，最普遍选用大肠 杆菌作为宿主。 优点： 人们对大肠杆菌的生理学和遗传学背景了解 得比其他任何生物深。有利于进行复杂的基因 操作； 大肠杆菌有相当高的生长速率，并能长到高 细胞浓度（50g/l）； 大肠杆菌能生长在简单的便宜的培养基上。
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3、宿主细胞突变 宿主细胞的突变也会造成生产能力的下降。 这些突变通常改变细胞调节，结果减少目标 蛋白的合成。例如，控制外源蛋白表达的启 动子，利用宿主细胞的启动子，如果宿主细 胞启动子的改变，将大大改变质粒编码蛋白 的生产水平。乳糖操纵子是常用是操纵子， 通过加入乳糖或它的结构类似物（如IPTG） 来启动表达，如果乳糖操纵子编码半乳糖苷 透酶的基因发生突变就会阻止乳糖或乳糖的 结构类似物进入细胞，从而不能启动细胞的 表达。
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4、控制比生长速率的葡萄糖流加 菌体的比生长速率与代谢产物的表达 密切相关。比生长速率太大，超过某 一值，易产生乙酸，这一比生长速率 值称为菌体的乙酸产生临界比生长速 率。通过考察得出最优比生长速率， 控制溶氧、转速、补糖来控制比生长 速率。
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五、生长与表达的影响因素
不同发酵条件下工程菌发酵结果 通气量 搅拌转速 DO pH OD600 诱导时间 菌体湿重 蛋白量 1 1 150 1.8 7.0 0.7 4 1.9 13.8% 2 2 250 2.6 7.8 0.77 4 2.08 16.7% 3 3 500 3.8 7.5 0.74 6 2.10 18.2% 4 3 500 4.0 7.0 0.83 6 2.27 26.4% 5 3 500 3.6 7.0 2.44 6 5.185 8.9% *鲤鱼生长激素基因工程菌
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4、诱导时机对表达的影响
诱导时机指加入诱导剂的时间
以天冬酰氨酶表达为例，见表。在 A600=0.295*10时生长速度比较快，这时菌 体进入诱导状态，酶蛋白的积累加快，酶 活和表达水平都较高。而菌体进入对数期 后期，由于发酵液中营养的消耗，及代谢 产物的积累，使菌体的生长速度受到抑制。 在此状态下诱导，表达显然受到影响。
蛋白类产物大多是外源基因片段整合到载 体（如质粒）上，然后转入宿主菌，表达 外源蛋白。 现代基因工程发酵的蛋白质产物主要是这 种方法构建重组菌
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细胞因子、疫苗、酶
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产品最主要的用于疾病的诊断和治疗， 此外还有用于畜牧业、食品或工业用的生 物催化剂。 产品特点：要求高纯度。如果不纯，病人 可能产生的强的免疫反应或副作用这对人 是灾难性的。 有的蛋白转译后还要进行修饰，如糖基 化、磷酸化后才有活性。 附加值高。治疗蛋白最主要的是保证产 品的质量和安全，降低成本并不重要。
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2、G+细菌
枯草杆菌是可替代大肠杆菌的菌种，它是 G+菌，它没有外膜，并且能把蛋白分泌 （excretion）到胞外。它的这一性质对生 产非常有吸引力。
枯草杆菌有许多问题妨碍它在商业上的应 用。主要是枯草杆菌产生大量的蛋白酶， 会很快降解产物。而且枯草杆菌基因构建 比大肠杆菌困难，质粒稳定性也比较差， 所以在使用上有较大的限制，