基因工程菌培养

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2、pH值对工程菌生长和表达的影响 在相同通气量和搅拌速度下，pH值对不同 菌群生长影响不大，而对外源蛋白表达有 一定影响。由于工程菌培养采用两阶段培 养工艺，前期为菌体生长阶段，后期为蛋 白诱导表达阶段。偏碱性的pH对外源蛋白 的表达不利，因此，表达时要调节pH在 6.8-7.0之间，以保证外源蛋白的高水平表 达。
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4、诱导时机对表达的影响
诱导时机指加入诱导剂的时间
以天冬酰氨酶表达为例，见表。在 A600=0.295*10时生长速度比较快，这时菌 体进入诱导状态，酶蛋白的积累加快，酶 活和表达水平都较高。而菌体进入对数期 后期，由于发酵液中营养的消耗，及代谢 产物的积累，使菌体的生长速度受到抑制。 在此状态下诱导，表达显然受到影响。
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3、诱导时间对外源蛋白表达的影响 诱导时间：加入诱导剂后的培养时间
随着诱导时间的延长，外源蛋白的表达量增加， 但外源蛋白在细胞内的积累，对重组菌产生毒 性，合成速率下降，甚至产物被分解。
诱导时间对酶表达水平和活力的影响 诱导时间 酶活力 酶表达水平 0 0.02 1 52.3 37% 2 118.8 57% 3 120.8 67% 4 165.0 68% 5 139.9 64% *L-天冬酰氨酶
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4、控制比生长速率的葡萄糖流加 菌体的比生长速率与代谢产物的表达 密切相关。比生长速率太大，超过某 一值，易产生乙酸，这一比生长速率 值称为菌体的乙酸产生临界比生长速 率。通过考察得出最优比生长速率， 控制溶氧、转速、补糖来控制比生长 速率。
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五、生长与表达的影响因素
不同发酵条件下工程菌发酵结果 通气量 搅拌转速 DO pH OD600 诱导时间 菌体湿重 蛋白量 1 1 150 1.8 7.0 0.7 4 1.9 13.8% 2 2 250 2.6 7.8 0.77 4 2.08 16.7% 3 3 500 3.8 7.5 0.74 6 2.10 18.2% 4 3 500 4.0 7.0 0.83 6 2.27 26.4% 5 3 500 3.6 7.0 2.44 6 5.185 8.9% *鲤鱼生长激素基因工程菌
1、分离丢失
当细胞分裂时一个子细胞没有接受质粒就出 现分离丢失。 为什么会出现质粒丢失呢？ 质粒可分为高拷贝质粒（>20拷贝/细胞）和 低拷贝质粒（有时低到每个细胞一至二个拷 贝）。低拷贝质粒有专门的机制保证在子代 细胞中有相等的分配，高拷贝质粒通常很少 遵循二分法分配到子代细胞。对于高拷贝质 粒，绝大多数子细胞接受一些质粒，也有可 能有的细胞没有接受质粒，出现质粒丢失。 虽然形成无质粒细胞的可能性是低的（每百 万细胞分裂中一个）。
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分离丢失示意图
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2、质粒结构不稳定性 除了分离不稳定性问题外，某些细胞保留 质粒，但质粒结构发生改变，而不产生外 源蛋白，减少对细胞的有害影响，这就是 结构不稳定性。如果质粒发生突变，仍保 留了抗生素抗性基因，但不合成外源蛋白， 那么这些突变株仍能在含有抗生素的培养 基中生长。而且由于不合成外源蛋白，生 长得比原来的工程菌更快，使得在这种培 养物中带有突变质粒的菌占统治地位，这 种培养情况就是结构不稳定性。
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4、哺乳动物细胞 哺乳动物细胞在表达时有正确的氨基酸排 列，而且所有转译后处理（修饰）与在整 个动物中相同，在某种情况下可能转译后 修饰有些不同，但它可提供最接近于天然 副本的产物，此外多数产物可以分泌到胞 外。 但动物细胞生长缓慢，培养基价格昂贵， 蛋白表达水平较低。用于重组DNA 生产蛋 白的最常用的宿主是CHO（中国仓鼠卵巢 细胞）。
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2、G+细菌
枯草杆菌是可替代大肠杆菌的菌种，它是 G+菌，它没有外膜，并且能把蛋白分泌 （excretion）到上的应 用。主要是枯草杆菌产生大量的蛋白酶， 会很快降解产物。而且枯草杆菌基因构建 比大肠杆菌困难，质粒稳定性也比较差， 所以在使用上有较大的限制，
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1、溶氧浓度对工程菌发酵的影响
在鲤鱼生长激素基因工程菌的发酵研究中发 现，当发酵液的溶氧为1.8~2.6ppm/L时， 菌体湿重为1.9~2.08g/L外源基因表达量为 13.8%~16.7%，而当溶氧值提高到 4.0ppm/L时菌体湿重为2.27g/L外源基因表 达量为26.4%。在诱导表达期间，要维持外 源基因的高水平转录和翻译，细胞需要大量 的能量代谢以促进呼吸作用。因此通过增大 通气量和提高搅拌转速以保证较大的溶氧值， 不仅提高工程菌的生长而且有利于外源蛋白 产物的形成。
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二、宿主-载体系统 构建基因工程菌，必须选择宿主和表达系统
要求：翻译后的修饰要简单
如果用于食品要考虑宿主菌要求安全， 列入FDA表中 常用的宿主系统有：大肠杆菌 G+细菌 低等真核细胞 哺乳动物细胞
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1、大肠杆菌 如果产品翻译后不需要修饰，最普遍选用大肠 杆菌作为宿主。 优点： 人们对大肠杆菌的生理学和遗传学背景了解 得比其他任何生物深。有利于进行复杂的基因 操作； 大肠杆菌有相当高的生长速率，并能长到高 细胞浓度（50g/l）； 大肠杆菌能生长在简单的便宜的培养基上。
高表达的障碍是： 外源基因的不稳定，造成表达的下降
高生长速率与高表达之间的矛盾
乙酸的产生
蛋白的降解
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高密度培养的措施
分批补料培养 以分批培养为基础，吸取 了连续培养的优点，可消除高浓度底物对 细胞生长的抑制作用，还可以弥补低浓度 底物限制细胞生长的缺陷，从而有效地控 制了菌体的生长过程。因此，要实现重组 大肠杆菌的高密度培养，最常用和最有效 的方法就是分批流加补料培养法。现在常 用的是反馈补料培养。有几种反馈控制
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3、低等真核细胞
酵母菌 酿酒酵母是第一个被人利用的生物 现在发展了其他的酵母如甲醇营养型酵母等 优点 生长快 最大生长速率是大肠杆菌的25% 个体大 酵母比最大的细菌大，容易从发 酵液中回收。 有简单糖基化能力和分泌蛋白的能力。 缺点 酵母达到高表达水平比大肠杆菌困难， 外源蛋白分泌到胞外也有限。 只能简单糖基化。 当产生的外源蛋白需要复杂的糖基化和翻译 后修饰时，要用动物细胞组织培养来达到。
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大肠杆菌作为宿主的主要问题是
大肠杆菌分泌(secretion)的蛋白通常在 细胞内，当这些蛋白达到高浓度时，会被 水解或形成不溶的包含体。包含体中的蛋 白是不折叠的，不折叠的蛋白没有生物活 性，必须重新溶解并使它复性。
大量的外源蛋白的产生会触发热冲击响 应。热冲击调节子的一种响应是增加蛋白 水解酶的活性。在一些情况下，细胞内蛋 白水解酶使蛋白的降解速率几乎等于产生 的速率。
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在大的反应器中含有非常多的细胞，总会 存在无质粒细胞，例如1000L发酵液，每 毫升有109个细胞，总共就有1015个细胞， 那么在这个反应器中就含有109个无质粒 细胞。 质粒的分离丢失受许多环境因素影响，如 溶氧、温度、培养基组成和恒化器中的稀 释速率。 许多质粒也会形成多聚体，它是相同质粒 附着在一起形成一个单位。
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控制基质浓度流加
恒pH流加
恒溶氧流加 控制比生长速率的葡萄糖流加
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1、控制基质浓度流加
用专门的电极维持基质浓度（如葡萄糖、乙 酸、氨等）。以葡萄糖为例，用葡萄糖电极 检测发酵液中的葡萄糖含量，葡萄糖电极通 过反馈系统与补糖单元相连。当葡萄糖浓度 在设定值之上，糖阀关闭；当葡萄糖浓度由 于菌体消耗低于设定值时，糖阀开启，葡萄 糖以一定速率加入。这样，发酵液中的葡萄 糖浓度始终保持恒定，可避免葡萄糖的抑制 效应，达到很高的细胞浓度。
基因工程菌培养
一、概述 基因工程菌生产的产品主要有二类，蛋白 质和非蛋白质。 基因操作： 敲除或插入基因片段、增强 启动子— —代谢工程 基因插入载体，转化工程菌
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非蛋白质产物大多可以通过代谢工程，改 造细胞的一些基因，如在细胞中插入编码 酶的DNA，产生新的途径或增强某一途径， 从而得到新的化合物或增加产量。
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4、生长速率占优势的不稳定性
所有这三种因素的关键是变异了的宿主载体 系统和原宿主-载体系统的生长速率不同。如 果变异了的宿主载体系统比原来的宿主-载体 系统有生长优势，那么变异了的系统将最终 占优势，基因不稳定性就出现。
（四）表达的诱导 基因工程菌的产物表达需要诱导，诱因主要 有：温度诱导、乳糖或乳糖结构类似物诱导、 氧饥饿诱导、葡萄糖饥饿诱导、甲醇诱导等。
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3、恒溶氧流加
用复膜氧电极来控制补糖。当培养液的氧饱 和百分数高于控制点，糖阀开启，以一定速 率补糖。加入的糖被菌利用则需要更多的氧， 从而降低溶氧浓度，引起读数下降。当读数 下降到控制点以下，糖阀关闭，需氧就会随 之减少，溶氧逐渐上升，从而达到供需平衡。 Konstantinov等进一步发展了这种方法，用 DO-state法间歇流加葡萄糖，通过控制溶氧、 搅拌转速及糖流加速率，使乙酸维持在低浓 度，从而获得高密度和高表达
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3、宿主细胞突变 宿主细胞的突变也会造成生产能力的下降。 这些突变通常改变细胞调节，结果减少目标 蛋白的合成。例如，控制外源蛋白表达的启 动子，利用宿主细胞的启动子，如果宿主细 胞启动子的改变，将大大改变质粒编码蛋白 的生产水平。乳糖操纵子是常用是操纵子， 通过加入乳糖或它的结构类似物（如IPTG） 来启动表达，如果乳糖操纵子编码半乳糖苷 透酶的基因发生突变就会阻止乳糖或乳糖的 结构类似物进入细胞，从而不能启动细胞的 表达。
蛋白类产物大多是外源基因片段整合到载 体（如质粒）上，然后转入宿主菌，表达 外源蛋白。 现代基因工程发酵的蛋白质产物主要是这 种方法构建重组菌
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细胞因子、疫苗、酶
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产品最主要的用于疾病的诊断和治疗， 此外还有用于畜牧业、食品或工业用的生 物催化剂。 产品特点：要求高纯度。如果不纯，病人 可能产生的强的免疫反应或副作用这对人 是灾难性的。 有的蛋白转译后还要进行修饰，如糖基 化、磷酸化后才有活性。 附加值高。治疗蛋白最主要的是保证产 品的质量和安全，降低成本并不重要。
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（三）基因不稳定性 生产的目标是得到最大量的外源蛋白，但 是大量外源蛋白的形成对宿主细胞是有损 害的，通常是致死的，失去制造外源蛋白 的能力的细胞一般生长得快得多，从而能 替代有生产能力的菌株，这就导致基因的 不稳定性。 基因的不稳定性原因： 分离丢失 结构不稳定性 宿主细胞调节突变
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四、重组大肠杆菌的培养策略
关键点：高密度、高表达 菌密度的测定：光密度（OD值或A值） 在波长600～660nm 菌生长的障碍是 重组菌携带外源基因，加重代谢负担，生长 缓慢 外源蛋白不能分泌到胞外，在菌体内合成后 就会造成积累。高表达的外源蛋白尤其是高度 疏水性蛋白对菌体有害，对细胞生长有抑制作 用，甚至会导致细胞中毒或死亡, 因此工程菌 的比生长速率往往远小于宿主菌。 19
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2、恒pH流加 大肠杆菌在LB培养基上生长，pH会上升。 这是由于菌体分解LB培养基中的胰蛋白胨， 造成氨积累的原因。因此用葡萄糖代替酸 液进行恒pH流加。实验通过pH反馈控制 系统流加葡萄糖，使pH恒定，结果推迟了 比生长速率降低的时间，细胞密度是无流 加的2倍。也可以以葡萄糖代替酸液，以氨 水代替氢氧化钠碱液，同时流加氨水和葡 萄糖。这种方法的缺点是葡萄糖浓度往往 不易控制，容易产生乙酸，对某些工程菌 不适宜。
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三、利用基因工程菌生产的特点 （一）基因工程菌带有外源基因，外源基 因可能在质粒上也可能整合到染色体上， 这些基因可能不稳定。丢失外源基因的菌 往往比未丢失质粒的菌生长快得多，这样 就会大大降低产物的表达。为了抑制基因 丢失的菌的生长，一般在培养中加入选择 压力，如抗生素。 （二）基因工程菌的培养一般分两段。前 期是菌体生长，生长到某一阶段，加入诱 导因子，诱发产物表达。
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诱导时机对酶表达水平和活力的影响 生物量（A600） 酶活力 酶表达水平 0.015 6.0 15.0% 0.034 0.049 19.1 31.1% 0.111 0.160 72.5 41.5% 0.065 0.225 102.6 49.8% 0.07 0.295 165.0 57.7% 0.065 0.360 105.5 53.4% 0.05 0.410 62.4 44.5% 0.04 0.450 30.2 22.5% *L-天冬酰氨酶