黄嘌呤氧化酶抑制剂筛选体系的建立
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关键词：黄嘌呤氧化酶；高尿酸血症；抑制剂；高通量筛选；急 性高尿酸血症小鼠模型；慢性高尿酸血症小鼠模型
高尿酸血症 （ｈｙｐｅｒｕｒｉｃｅｍｉａ，ＨＵＡ）是一种嘌呤代谢紊 乱。当男、女 血 尿 酸 水 平 分 别 超 过 ７ｍｇ· ｄＬ－１及 ６ｍｇ· ｄＬ－１时，可以临床诊断为高尿酸血症。中国高尿酸血症的发 病率逐年上升，患 者 人 数 多，易 发 展 为 痛 风 ［１－２］。 现 有 的 流 行病学和实验分析表明，高尿酸血症不仅仅是痛风的直接致 病因素，而且还与代谢综合征、高血压、肾损伤、脂质代谢紊 乱、心血管疾病等有着密切联系，作为风险因素，高尿酸血症 对这些疾病的病 程 发 展 产 生 重 要 作 用 ［３－４］。 人 和 禽 类 体 内
中国药理学通报 ＣｈｉｎｅｓｅＰｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌＢｕｌｌｅｔｉｎ ２０１９Ｏｃｔ；３５（１０）：１４７１～７
·１４７１·
ຫໍສະໝຸດ Baidu
网络出版时间：２０１９－９－５９：３３ 网络出版地址：ｈｔｔｐ：／／ｋｎｓ．ｃｎｋｉ．ｎｅｔ／ｋｃｍｓ／ｄｅｔａｉｌ／３４．１０８６．ｒ．２０１９０９０４．０９４０．０５０．ｈｔｍｌ
无尿酸酶，体内嘌呤代谢的终产物为尿酸，而啮齿类体内因 有尿酸酶的存在，尿酸最终会被氧化成尿囊素排出体外［５］。 治疗高尿酸血症药物的主要作用靶点是黄嘌呤氧化酶（ｘａｎ ｔｈｉｎｅｏｘｉｄａｓｅ，ＸＯＤ），可 以 催 化 次 黄 嘌 呤 或 黄 嘌 呤，生 成 尿 酸的一种黄素钼蛋白，广泛分布于小鼠的各个脏器中［６］。抑 制 ＸＯＤ的活性，可以直接降低体内尿酸生成量，减低体内的 血尿酸水平。临床选择性 ＸＯＤ抑制剂包括别嘌呤醇（一种 嘌呤类抑制剂）及非布索坦（一种非嘌呤类抑制剂）［７－８］。
目前，高尿酸血症模型动物主要为啮齿类和禽类［５］。根 据尿酸的生成及排泄路径，造模方式主要包括增加尿酸前体 物质的摄入、抑制啮齿类动物的尿酸酶、减少尿酸排泄。可采 取单一因素诱导，或多种因素联合诱导形成高尿酸血症动物 模型。本研究根据 ＸＯＤ性质，完善了体外 ＸＯＤ抑制剂筛选 方法，建立了急性及慢性高尿酸血症模型等体内实验方法，为 基于高尿酸血症的分子靶点 ＸＯＤ药物研发奠定了实验基础。 １ 材料与方法 １．１ 材料 １．１．１ 药物与试剂 牛奶来源 ＸＯＤ１（ＣＡＳ９００２１７９）、微 生物 来 源 ＸＯＤ２（ＣＡＳ９００２１７９）、黄 嘌 呤 （ｘａｎｔｈｉｎｅ，ＸＡ， ＣＡＳ６９８９６）、次黄嘌呤 （ｈｙｐｏｘａｎｔｈｉｎｅ，ＣＡＳ６８９４０），均购 自 Ｓｉｇｍａ公司；氧嗪酸钾（ｏｔｅｒａｃｉｌｐｏｔａｓｓｉｕｍ，ＣＡＳ２２０７７５２）， 购自美仑生物；非布索坦 （ｆｅｂｕｘｏｓｔａｔ，ＦＢＸ，ＣＡＳ１４４０６０５３ ７），购自 ＴＣＩ公司；别嘌呤醇（ａｌｌｏｐｕｒｉｎｏｌ，ＡＬＰ，ＣＡＳ３１５３０ ０），购自 ＡｌｆａＡｅｓａｒ公司；谷草转氨酶 （ａｓｐａｒｔａｔｅａｍｉｎｏｔｒａｎｓ ｆｅｒａｓｅ，ＡＳＴ）、血尿酸（ｕｒｉｃａｃｉｄ，ＵＡ）、谷丙转氨酶 （ａｌａｎｉｎｅ ａｍｉｎｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ，ＡＬＴ）、肌酐 （ｃｒｅａｔｉｎｉｎｅ，Ｃｒｅ）、尿素 （Ｕｒｅａ） 测定试剂盒，均购自北京中生北控生物技术有限公司；ＸＯＤ 活性测定试剂盒，购自南京建成生物科技有限公司。 １．１．２ 仪器 酶标仪（美国 ＢｉｏＴｅｋ公司）；ＴＨＺＣ型恒温振 荡器（江苏太仓科教仪器厂）；高速低温离心机（德国 Ｈｅｒａｅ ｕｓ公司）；ｐＨ计（美国 ＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ公司）。 １．１．３ 实验动物 ＩＣＲ小鼠，♂，购于北京维通利华生物科 技股份有限公司，许可证编号为 ＳＣＸＫ（京）２０１６０００６。饲养 于中国医学科学院药物研究所实验动物管理中心，饲养温度 为（２２～２５）℃，湿度为 ４０％ ～６０％，每天光照时间和黑暗时 间各为 １２ｈ，进食及饮水自由。小鼠经过动物伦理委员会批 准，动物使用许可证编号：ＳＹＸＫ（京）２０１４００２３。 １．２ 方法 １．２．１ 血 清 生 化 测 定 ３５００ｒ· ｍｉｎ－１离 心 小 鼠 全 血 ４ ｍｉｎ，取 出 上 层 血 清，按 照 试 剂 盒 说 明 书 对 ＵＡ、ＡＳＴ、ＡＬＴ、 Ｃｒｅ、Ｕｒｅａ、ＸＯＤ进行测定。
◇实验方法学◇
黄嘌呤氧化酶抑制剂筛选体系的建立
闫祯昕，尹 非，李雪晨，姜 楠，田金英，叶 菲
（中国医学科学院北京协和医学院药物研究所，新药作用机制研究与药效评价北京市重点实验室，北京 １０００５０）
ｄｏｉ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１００１－１９７８．２０１９．１０．０２５ 文献标志码：Ａ 文章编号：１００１－１９７８（２０１９）１０－１４７１－０７ 中国图书分类号：Ｒ３３２；Ｒ３２２４７；Ｒ３４５４９；Ｒ３６３３３２；Ｒ４４６１１； Ｒ５８９９；Ｒ９７７３ 摘要：目的 建立黄嘌呤氧化酶（ｘａｎｔｈｉｎｅｏｘｉｄａｓｅ，ＸＯＤ）抑 制剂筛选体系。方法 应用理化法，测定体外 ＸＯＤ活性、血 尿酸、血清 ＸＯＤ活性、组织 ＸＯＤ活性及肝肾功能有关血液 指标；病理分析肝脏肾脏的损伤情况。结果 选择牛奶来源 ＸＯＤ３Ｕ· Ｌ－１，黄 嘌 呤 （Ｘａｎｔｈｉｎｅ，ＸＡ）５０μｍｏｌ· Ｌ－１，３７ ℃，ｐＨ７４，２０ｍｉｎ为 ＸＯＤ抑制剂体外高通量筛选的最适 条件。单次灌胃次黄嘌呤联合皮下注射氧嗪酸钾诱导 ＩＣＲ 小鼠，血尿酸水平一过性升高；以血尿酸变化曲线和血尿酸 －时间曲线下面积评价急性高尿酸血症小鼠模型。ＩＣＲ小 鼠连续皮下注射氧嗪酸钾血尿酸平稳升高，成模率约 ７０％； 以血尿酸水平评价慢性高尿酸血症小鼠模型。上述 ２种模 型动物的血清和组织 ＸＯＤ活性均未见明显变化，肝脏肾脏 均未见明显损伤。结论 ＸＯＤ抑制剂体外筛选方法与急性 高尿酸血症小鼠模型、慢性高尿酸血症小鼠模型等体内实验 方法相互验证，形成基于分子靶点 ＸＯＤ的抗高尿酸血症药 物研发的实验体系。
收稿日期：２０１９－０７－１１，修回日期：２０１９－０８－１５ 基金项目：国家自然科学基金青年基金项目（Ｎｏ８１６００５４６）；中国医
学科学院医学与健康科技创新工程团队项目 （ＮｏＣＩＦＭＳ ２０１６Ｉ２Ｍ３０１２）；国家“重大新药创制”科技重大专项（Ｎｏ ２０１８ＺＸ０９７１１００１００３００５） 作者简介：闫祯昕（１９９４－），女，硕士生，研究方向：抗代谢综合征药 理学，Ｅｍａｉｌ：５１０４８２８０６＠ｑｑ．ｃｏｍ； 叶 菲（１９６４－），女，研 究 员，硕 士 生 导 师，研 究 方 向：抗 代谢综合征药理学，通讯作者，Ｅｍａｉｌ：ｙｅｆｅｉ＠ｉｍｍ．ａｃ．ｃｎ
高尿酸血症 （ｈｙｐｅｒｕｒｉｃｅｍｉａ，ＨＵＡ）是一种嘌呤代谢紊 乱。当男、女 血 尿 酸 水 平 分 别 超 过 ７ｍｇ· ｄＬ－１及 ６ｍｇ· ｄＬ－１时，可以临床诊断为高尿酸血症。中国高尿酸血症的发 病率逐年上升，患 者 人 数 多，易 发 展 为 痛 风 ［１－２］。 现 有 的 流 行病学和实验分析表明，高尿酸血症不仅仅是痛风的直接致 病因素，而且还与代谢综合征、高血压、肾损伤、脂质代谢紊 乱、心血管疾病等有着密切联系，作为风险因素，高尿酸血症 对这些疾病的病 程 发 展 产 生 重 要 作 用 ［３－４］。 人 和 禽 类 体 内
中国药理学通报 ＣｈｉｎｅｓｅＰｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌＢｕｌｌｅｔｉｎ ２０１９Ｏｃｔ；３５（１０）：１４７１～７
·１４７１·
ຫໍສະໝຸດ Baidu
网络出版时间：２０１９－９－５９：３３ 网络出版地址：ｈｔｔｐ：／／ｋｎｓ．ｃｎｋｉ．ｎｅｔ／ｋｃｍｓ／ｄｅｔａｉｌ／３４．１０８６．ｒ．２０１９０９０４．０９４０．０５０．ｈｔｍｌ
无尿酸酶，体内嘌呤代谢的终产物为尿酸，而啮齿类体内因 有尿酸酶的存在，尿酸最终会被氧化成尿囊素排出体外［５］。 治疗高尿酸血症药物的主要作用靶点是黄嘌呤氧化酶（ｘａｎ ｔｈｉｎｅｏｘｉｄａｓｅ，ＸＯＤ），可 以 催 化 次 黄 嘌 呤 或 黄 嘌 呤，生 成 尿 酸的一种黄素钼蛋白，广泛分布于小鼠的各个脏器中［６］。抑 制 ＸＯＤ的活性，可以直接降低体内尿酸生成量，减低体内的 血尿酸水平。临床选择性 ＸＯＤ抑制剂包括别嘌呤醇（一种 嘌呤类抑制剂）及非布索坦（一种非嘌呤类抑制剂）［７－８］。
目前，高尿酸血症模型动物主要为啮齿类和禽类［５］。根 据尿酸的生成及排泄路径，造模方式主要包括增加尿酸前体 物质的摄入、抑制啮齿类动物的尿酸酶、减少尿酸排泄。可采 取单一因素诱导，或多种因素联合诱导形成高尿酸血症动物 模型。本研究根据 ＸＯＤ性质，完善了体外 ＸＯＤ抑制剂筛选 方法，建立了急性及慢性高尿酸血症模型等体内实验方法，为 基于高尿酸血症的分子靶点 ＸＯＤ药物研发奠定了实验基础。 １ 材料与方法 １．１ 材料 １．１．１ 药物与试剂 牛奶来源 ＸＯＤ１（ＣＡＳ９００２１７９）、微 生物 来 源 ＸＯＤ２（ＣＡＳ９００２１７９）、黄 嘌 呤 （ｘａｎｔｈｉｎｅ，ＸＡ， ＣＡＳ６９８９６）、次黄嘌呤 （ｈｙｐｏｘａｎｔｈｉｎｅ，ＣＡＳ６８９４０），均购 自 Ｓｉｇｍａ公司；氧嗪酸钾（ｏｔｅｒａｃｉｌｐｏｔａｓｓｉｕｍ，ＣＡＳ２２０７７５２）， 购自美仑生物；非布索坦 （ｆｅｂｕｘｏｓｔａｔ，ＦＢＸ，ＣＡＳ１４４０６０５３ ７），购自 ＴＣＩ公司；别嘌呤醇（ａｌｌｏｐｕｒｉｎｏｌ，ＡＬＰ，ＣＡＳ３１５３０ ０），购自 ＡｌｆａＡｅｓａｒ公司；谷草转氨酶 （ａｓｐａｒｔａｔｅａｍｉｎｏｔｒａｎｓ ｆｅｒａｓｅ，ＡＳＴ）、血尿酸（ｕｒｉｃａｃｉｄ，ＵＡ）、谷丙转氨酶 （ａｌａｎｉｎｅ ａｍｉｎｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ，ＡＬＴ）、肌酐 （ｃｒｅａｔｉｎｉｎｅ，Ｃｒｅ）、尿素 （Ｕｒｅａ） 测定试剂盒，均购自北京中生北控生物技术有限公司；ＸＯＤ 活性测定试剂盒，购自南京建成生物科技有限公司。 １．１．２ 仪器 酶标仪（美国 ＢｉｏＴｅｋ公司）；ＴＨＺＣ型恒温振 荡器（江苏太仓科教仪器厂）；高速低温离心机（德国 Ｈｅｒａｅ ｕｓ公司）；ｐＨ计（美国 ＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ公司）。 １．１．３ 实验动物 ＩＣＲ小鼠，♂，购于北京维通利华生物科 技股份有限公司，许可证编号为 ＳＣＸＫ（京）２０１６０００６。饲养 于中国医学科学院药物研究所实验动物管理中心，饲养温度 为（２２～２５）℃，湿度为 ４０％ ～６０％，每天光照时间和黑暗时 间各为 １２ｈ，进食及饮水自由。小鼠经过动物伦理委员会批 准，动物使用许可证编号：ＳＹＸＫ（京）２０１４００２３。 １．２ 方法 １．２．１ 血 清 生 化 测 定 ３５００ｒ· ｍｉｎ－１离 心 小 鼠 全 血 ４ ｍｉｎ，取 出 上 层 血 清，按 照 试 剂 盒 说 明 书 对 ＵＡ、ＡＳＴ、ＡＬＴ、 Ｃｒｅ、Ｕｒｅａ、ＸＯＤ进行测定。
◇实验方法学◇
黄嘌呤氧化酶抑制剂筛选体系的建立
闫祯昕，尹 非，李雪晨，姜 楠，田金英，叶 菲
（中国医学科学院北京协和医学院药物研究所，新药作用机制研究与药效评价北京市重点实验室，北京 １０００５０）
ｄｏｉ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１００１－１９７８．２０１９．１０．０２５ 文献标志码：Ａ 文章编号：１００１－１９７８（２０１９）１０－１４７１－０７ 中国图书分类号：Ｒ３３２；Ｒ３２２４７；Ｒ３４５４９；Ｒ３６３３３２；Ｒ４４６１１； Ｒ５８９９；Ｒ９７７３ 摘要：目的 建立黄嘌呤氧化酶（ｘａｎｔｈｉｎｅｏｘｉｄａｓｅ，ＸＯＤ）抑 制剂筛选体系。方法 应用理化法，测定体外 ＸＯＤ活性、血 尿酸、血清 ＸＯＤ活性、组织 ＸＯＤ活性及肝肾功能有关血液 指标；病理分析肝脏肾脏的损伤情况。结果 选择牛奶来源 ＸＯＤ３Ｕ· Ｌ－１，黄 嘌 呤 （Ｘａｎｔｈｉｎｅ，ＸＡ）５０μｍｏｌ· Ｌ－１，３７ ℃，ｐＨ７４，２０ｍｉｎ为 ＸＯＤ抑制剂体外高通量筛选的最适 条件。单次灌胃次黄嘌呤联合皮下注射氧嗪酸钾诱导 ＩＣＲ 小鼠，血尿酸水平一过性升高；以血尿酸变化曲线和血尿酸 －时间曲线下面积评价急性高尿酸血症小鼠模型。ＩＣＲ小 鼠连续皮下注射氧嗪酸钾血尿酸平稳升高，成模率约 ７０％； 以血尿酸水平评价慢性高尿酸血症小鼠模型。上述 ２种模 型动物的血清和组织 ＸＯＤ活性均未见明显变化，肝脏肾脏 均未见明显损伤。结论 ＸＯＤ抑制剂体外筛选方法与急性 高尿酸血症小鼠模型、慢性高尿酸血症小鼠模型等体内实验 方法相互验证，形成基于分子靶点 ＸＯＤ的抗高尿酸血症药 物研发的实验体系。
收稿日期：２０１９－０７－１１，修回日期：２０１９－０８－１５ 基金项目：国家自然科学基金青年基金项目（Ｎｏ８１６００５４６）；中国医
学科学院医学与健康科技创新工程团队项目 （ＮｏＣＩＦＭＳ ２０１６Ｉ２Ｍ３０１２）；国家“重大新药创制”科技重大专项（Ｎｏ ２０１８ＺＸ０９７１１００１００３００５） 作者简介：闫祯昕（１９９４－），女，硕士生，研究方向：抗代谢综合征药 理学，Ｅｍａｉｌ：５１０４８２８０６＠ｑｑ．ｃｏｍ； 叶 菲（１９６４－），女，研 究 员，硕 士 生 导 师，研 究 方 向：抗 代谢综合征药理学，通讯作者，Ｅｍａｉｌ：ｙｅｆｅｉ＠ｉｍｍ．ａｃ．ｃｎ