细胞生物学研究方法

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二、课时教学内容第页

技术的进步在一门学科的建立与发展过程中起着巨大的作用。没有

显微镜的发明就没有细胞的发现，更不会有细胞学说的建立，没有电子显微技术及其分子生物学技术的结合，就不会有细胞生物学今天的发展。

细胞生物学研究方法：一般来说，凡是用来解决细胞生物学问题所采用的方法，都属于细胞生物学研究方法。当前细胞生物学研究中常用到的方法有:核酸和蛋白质成分的分析和序列测定、研究特异DNA、RNA常用的southern杂交、Northwre杂交及蛋白质免疫印迹技术、基因打靶技术等等。

第一节细胞形态结构的观察方法

一、有关显微镜的一些概念

（1）分辨率（resolution）：指分辨物体最小间隔的能力。

光学显微镜的分辨率 R=0.61λ/N．sin（α/2）．

其中λ为入射光线波长；

N =介质折射率；空气中N =1

α=物镜镜口角（样品对物镜镜口的张角）。

（2）放大倍数（magnification）：是指眼睛看到像的大小与对应标本大小的比值。它指的是长度的比值而不是面积的比值。

例：放大倍数为100×，指的是长度是1μm的标本，放大后像的长度是100μm，要是以面积计算，则放大了10,000倍。

►转速10~25kr/min的离心机称为高速离心机。

►转速>25kr/min，离心力>89Kg者称为超速离心机。

超速离心机的最高转速可达100000r/min，离心力超过500kg。（一）差速离心 Differential centrifugation

►特点：

介质密度均一；

速度由低向高，逐级离心。

►用途：分离大小相差悬殊的细胞和细胞器。

►常用介质：氯化铯、蔗糖、多聚蔗糖。

►分离活细胞的介质要求：

1）能产生密度梯度，且密度高时，粘度不高；

2）PH中性或易调为中性；

3）浓度大时渗透压不大；

4）对细胞无毒。

1. 速度沉降 velocity sedimentation

►用途：分离密度相近而大小不等的细胞或细胞器。

►特点：介质密度较低，介质的最大密度应小于被分离生物颗粒的最小密度。

►原理：介质密度梯度平缓，分离物按各自的沉降系数以不同的速度沉降而达到分离。

2.等密度沉降 isopycnic sedimentation

►用途：分离密度不等的颗粒。

►特点：

介质密度高，陡度大，介质最高密度大于被分离组分的最大密度。

力场比速率沉降法大10~100倍，需要高速或超速离心。

形成红色沉淀，（有色复合物）蛋白质

5、联苯胺反应：过氧化酶分解H202。产生新生氧，后者再将无色联苯胺氧化成联苯胺蓝，进而变成棕色化合物。

6、脂溶染色法：借苏丹染料溶于脂类而使脂类显色。

7、茚三酮反应：显示蛋白质

三、特异蛋白抗原的定位与定性

细胞内蛋白质定位法：免疫荧光技术和免疫电镜技术

蛋白质体外定性法：免疫印迹、放射免疫沉淀、蛋白质芯片和质谱分析（一）免疫荧光技术

根据免疫学原理，利用抗体同特定抗原专一结合，并标上标记荧光素，对抗原进行定位测定的技术。

快速、灵敏、有特异性，但其分辨率有限。

（二）免疫电镜技术

能有效提高样品的分辨率，在超微结构水平上研究特异蛋白抗原的定位。

免疫铁蛋白技术

免疫酶标技术

免疫胶体金技术

应用：通过对分泌蛋白的定位，可以确定某种蛋白的分泌动态；胞内酶的研究；膜蛋白的定位与骨架蛋白的定位等

四、细胞内特异核酸序列的定位和定性

分子杂交技术：具有互补核苷酸序列的两条单链核苷酸分子片段，在适当条件下，通过氢键结合，形成DNA-DNA，DNA-RNA或RNA-RNA杂交的双链分子。这种技术可用来测定单链分子核苷酸序列间是否具有互补关系。

►原位杂交（in situ hybridization）。

用于检测染色体上的特殊DNA序列。最初是使用放射性DNA探针，后来又发明了免疫探针法。

五、应用放射自显影技术研究生物大分子在细胞内的合成动态

►用于研究标记化合物在机体、组织和细胞中的分布、定位、排出以及合成、更新、作用机理、作用部位等等。

►原理：将放射性同位素标记的化合物导入生物体内，经过一段时间后，制取切片，涂上卤化银乳胶，经放射性曝光，使乳胶感光，对细胞内生物大分子进行定性、定位和半定量研究的一种细胞化学技术。

►一般用14C和3H标记。常用3H-TDR来显示DNA，用3H-UDR显示RNA；用

3H氨基酸研究蛋白质，用3H甘露糖、3H岩藻糖研究多糖。

14C半衰期为5730年，3H为12.5年。

六、定量细胞化学分析技术

1、流式细胞仪

►用途：对单个细胞进行快速定量分析与分选的一门技术。

►可定量地测定某一细胞中的DNA，RNA或某一特异蛋白的含量，以及细胞群体中上述成分含量不同的细胞的数量。特别是它还可将某一特异染色的细胞从数以万计的细胞群体中分离出来，以及将DNA含量不同的中期染色体，甚至X或Y染色体的精子分离出来。

►原理：包在鞘液中的细胞通过高频振荡控制的喷嘴，形成包含单个细胞的液滴，在激光束的照射下，这些细胞发出散射光和荧光，经探测器检

细胞贴壁：分散的细胞悬液在培养瓶中很快（几十分钟货数小时内）就贴附于瓶壁上的现象。

（二）、植物细胞培养

1.原生质体培养：培养脱壁后的细胞，特点：

①比较容易摄取外来的遗传物质，如DNA；

②便于进行细胞融合，形成杂交细胞；

③适宜条件下可产生细胞壁，经诱导分化成完整植株。

2.单倍体培养：通过花药或花粉培养可获得单倍体植株。

(三)、非细胞体系

来源于细胞，而不具有完整的细胞结构，但包含了进行正常生物学反应所需的物质（如供能系统和酶反应体系等）组成的体系即为非细胞体系（cell-free system）。

用途：研究DNA复制、RNA转录、蛋白质合成、高尔基体的膜泡运输机制