分光光度法测定榄香烯脂质体磷脂含量_曾昭武

分光光度法测定榄香烯脂质体磷脂含量

曾昭武，周广林，展晓日，谢恬（通讯作者）

（杭州师范大学生物医药与健康研究中心，江苏杭州310012）

[摘要]目的：探索简单快速检测榄香烯脂质体磷脂含量的方法。方法：采用氯仿破坏脂质体，硫氰铁铵与磷脂反应生成配位化合物，在468nm处检测其吸收度，计算其磷脂含量。结果：回归方程为A=10.65C－0.325，在0.10-0.35mg·mL-1范围内成线性。平均加样回收率为113.3%(n=9)，RSD%为7.9%，其RSD值较大，超过5%。日内差异度RSD%为2.1%(n=9)，日间差异度RSD%为4.0%(n=9)。榄香烯脂质体的磷脂含量为（19.95±1.76）mg·mL-1，RSD%为8.8%，大于5%。结论：分光光度法测定磷脂含量简单、快速，但尚不够精确，适用于榄香烯磷脂含量的快速粗略分析。

[关键词]分光光度法；榄香烯；脂质体

[中图分类号]R927.2[文献标识码]A[文章编号]1672-951X（2009）11-0054-02

Determination of Phospholipid Content of Elemene Liposomes

with Spectrophotometric Method

ZENG Zhao-wu,ZHOU Guang-lin,ZHAN Xiao-ri,XIE Tian

Hangzhou Normal University,Hangzhou,China,310012

[Abstract]Objective:To detect simply and fastly phospholipid content of elemene liposomes.Methods:Liposomes were destroyed using chloroform,and the coordination compound was generated by reaction of Ammonium Ferrothiocyanate and phospholipid.The absorption was detected at468nm,and phospholipid content was calculated.Results:Its regression equation is A=10.65C-0.325,and its linear range was0.10-0.35mg·mL-1.Its average recovery was113.3%(n=9)，RSD%was7.9% and more than5%.The RSD of intra-day and inter-day precision was2.1%(n=9)and4.0%(n=9).The content of elemene liposomes was(19.95±1.76)mg·mL-1,RSD%was8.8%and more than5%.Conclusion:Spectrophotometric method for determi－nation of phospholipid content was simple and fast,but not accurate enough,so it can be used for detecting phospholipid content of elemene liposomes fastly and roughly.

[Key words]Spectrophotometric method;Elemene;Liposomes

榄香烯是从莪术等中药中提取出来的一种抗癌有效成分，可用于多种肿瘤的治疗[1,2]。作者将其制成脂质体剂型，进行质量分析时需要检测其磷脂含量。磷脂含量是衡量脂质体稳定性的一项重要指标，脂质体中磷脂含量测定各国药典均未收载。磷脂的经典测定方法为无机定磷法，该法准确性高，但操作繁琐，且不能反映对磷脂的氧化降解程度。分光光度法测定磷脂含量已有少量报道[3,4]，但作者在实验中发现尚存在一些问题，报告如下。

1试剂与仪器

榄香烯脂质体，自制。卵磷脂，上海爱康精细化工有限公司。氯仿、硫氰酸铵、三氯化铁等购自杭州天威工贸有限公司。纯化水，自制。2550型紫外可见分光光度仪，日本岛津公司。BS224S型精密电子天平，德国赛多利斯公司。WH861型涡旋振荡仪，华利达公司。

2实验方法

2.1试验原理用氯仿破坏脂质体，加硫氰铁铵显色剂。红色的硫氰铁铵不溶于氯仿，但与卵磷脂反应生成的配位化合物能溶于氯仿，且在某个波长处有最大吸收，而磷脂与榄香烯等在此处吸收很小，通过测定该配位化合物的吸收度可得到脂质体中磷脂的含量。

2.2溶液的制备

2.2.1标准溶液精密称取卵磷脂100mg，置于100mL容量瓶中，加氯仿溶解并稀释至刻度，摇匀，制成浓度为1mg·mL-1的卵磷脂标准溶液，4℃保存，备用。

2.2.2卵磷脂样品溶液精密称取卵磷脂100，200，300mg，置于100mL容量瓶中，加氯仿溶解并稀释至刻度，摇匀，制成浓度为1,2,3mg·mL-1的卵磷脂样品溶液，4℃保存，备用。

2.2.3显色剂准确称取三氯化铁2.70g、硫氰酸铵

3.04g，置于100mL容量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，制成显色剂（室温下可保存数月）。

2.3测定波长的选择精密吸取1mg·mL-1的卵磷脂标准溶液0.4mL，置于试管中，加硫氰铁铵溶液2.0mL，再补加氯仿，

54

使试管中氯仿的最终体积为2.0mL ，涡旋振荡5min ，静置5min ，小心移去上层液，取下层，以氯仿为空白，于200-550nm 波长内进行扫描。2.4

标准曲线的绘制

精密吸取1mg ·mL -1的卵磷脂标准溶

液0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7mL ，分别置于试管中，加硫氰铁铵溶液2.0mL ，再补加氯仿，使试管中氯仿的最终体积为2.0mL ，涡旋振荡5min ，静置5min ，小心移去上层液，取下层，以氯仿为空白，在468nm 波长处测定吸光度(A)。以A 对浓度(C)进行回归分析，得回归方程。2.5

加样回收率试验

精密吸取0.1mL 不同浓度的卵磷脂

氯仿溶液（1,2,3mg ·mL -1）置于试管中，每个浓度各3份，再加入0.1mL 的2mg ·mL -1卵磷脂标准溶液，再加硫氰铁铵溶液2.0mL ，再补加氯仿，使试管中氯仿的最终体积为2.0mL 。再按“2.4”项下方法进行操作，并根据标准曲线方程计算加样回收率。加样回收率=(测定量－已含量)/加入量×100％。2.6

精密度试验

选用低、中、高不同浓度的卵磷脂样品溶

液(1,2,3mg ·mL -1)，于1d 和1周内重复测定3次，计算日内精密度和日间精密度。2.7

样品含量测定

精密吸取榄香烯脂质体25μL ，用氯仿

破坏脂质体，加硫氰铁铵溶液2.0mL ，再补加氯仿，使试管中氯仿的最终体积为2.0mL ，按“2.4”项下方法进行操作，通过标准曲线计算磷脂含量。

3

结

果

3.1测定波长的选择波长扫描结果表明，磷脂在400-550nm 有一吸收峰，在468nm 波长处有最大吸收，因此选择468nm 作为测定波长。（见图1）

图1硫氰铁铵-卵磷脂配合物分光光度仪扫描图谱

3.2标准曲线回归方程为A =10.65C －0.325，r 值为0.9935，

说明在0.10-0.35mg ·mL -1范围内成线性。

3.3加样回收率试验平均加样回收率为113.3%(n=9)，RSD %为7.9%。其RSD 值较大，超过5%。（见表1）3.4

精密度试验

日内差异RSD %为2.1%(n=9)，日间差异

RSD %为4.0%(n=9)，其RSD 值超过2%。见表2-3。

表2

日内精密度

（mg ·mL -1）

时间1234567898∶000.110.100.110.190.200.210.300.280.2912∶000.110.110.110.190.200.190.300.300.3016∶000.110.110.100.210.200.200.280.290.28

表3

日间精密度

（mg ·mL -1）

时间123456789

第1天0.110.100.110.190.200.210.300.280.29第3天0.120.120.110.200.210.210.280.310.32第6天0.120.120.130.190.190.190.300.290.303.5

含量测定结果

检测3批样品（处方相同），每批样品检

测3次，结果见表4。结果发现，榄香烯脂质体的平均磷脂含量为（19.95±1.76）mg ·mL -1

，

其RSD %为8.8%，大于5%。表4榄香烯脂质体磷脂含量测定

批号含量（mg ·mL -1）

平均值（mg ·mL -1）

RS D （%）1-116.951-219.2818.54±1.38

7.4

1-319.402-1

22.632-219.1121.40±1.999.3

2-322.463-119.763-220.6519.91±0.68 3.43-319.31

总19.95±1.76

8.8

4

讨

论

作者在实验中发现，当采用文献[3]的方法时，乙醇、氯

表1

加样回收率试验

实验序号123456789样品卵磷脂含量(mg)0.100.100.100.200.200.200.300.300.30加入卵磷脂量(mg)0.200.200.200.200.200.200.200.200.20总检出量(mg)0.320.330.330.450.420.400.520.550.52回收率(%)110.0

115.0

115.0

125.0

110.0100.0

110.0

125.0

110.0

平均回收率(%)

113.3RSD （%）

7.9

55