分解尿素的微生物的分离和计数

思考2：由于初次实验，对于稀释的范围没有把握，应该怎么做？
由于初次实验，对于稀释的范围没有把握，因此选择了一 个较为宽泛的范围：稀释倍数为103～107。（预实验）
注意事项：
1、应在火焰旁称取土壤10g。
2、在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁进行。 3、本实验使用的平板和试管比较多。为避免混淆，最好 在使用前做好标记。针对培养皿应注明培养基种类、培 养日期以及平板上培养样品的稀释度等。
（2011新课标39）．【生物 ——选修1：生物技术实践】 有些细菌可分解原油，从而消除由原油泄漏造成的土壤污染。 某同学欲从受原油污染的土壤中筛选出高效降解原油的菌株。 回答问题： （1）在筛选过程中，应将土壤样品稀释液接种于以 为唯一 碳源的固体培养基上，从功能上讲，该培养基属于____ 培养基。 （2）纯化菌种时，为了得到单菌落，常采用的接种方法有两 种，即 和 。 （3）为了筛选出高效菌株，可比较单菌落周围分解圈的大小， 分解圈大的说明该菌株的降解能力 。 （4）通常情况下，在微生物培养过程中实验室常用的灭菌方 法有灼烧灭菌、 和 。无菌技术 要求实验操作应在酒精灯 附近进行，以避免周围环 23 境中微生物的污染。
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资料二.样品的稀释
将样品液稀释，选用一定稀释范围的样品液进行培 养，以保证获得菌落数在30-300之间，适于计数的平板。 思考1：分离不同的微生物能采用相同的稀释度吗？测定土壤中
细菌的总量和测定土壤中能分解尿素的细菌的数量，选用的稀释 范围相同吗？ 不同微生物在土壤中含量不同（土壤中各类微生物的数量 （单位：株/kg）是不同的。例如在干旱土壤中的上层样本中： 好氧及兼性厌氧细菌数约为2185万，放线菌数约为477万，霉菌 数约为23.1万）。因此为保证获得菌落数在30～300之间、适于 计数的平板，需要针对不同的对象采用不同的稀释度。
思考： 1、尝试分析该培养基 类型和营养成分。
2、分析该配方的培养基对微生物是否具有选择作用？ 如果有，又是如何进行选择的？
培养基的唯一氮源为尿素，只有能合成脲酶的微生物才能分解尿 素，以尿素作为氮源。缺乏脲酶的微生物由于不能分解尿素，缺乏 氮源而不能生长发育繁殖，而受到抑制。
3、该如何证明该培养基具有选择作用？
可以根据培养基上黑色菌落的数目，计算出水样中
大肠杆菌的数量。
知识三 实验设计
土壤取样 制备培养基 样品的稀释 取样涂布 微生物的培养与观察 细菌的计数
知识三 实验设计和实验步骤 资料一 .土壤取样 土壤是“微生物天然的培养基”，大约70-90%的是细菌，在酸碱度接近中性的潮湿土 壤中生长，绝大多数分布在距地表约3-8cm的 土壤层。 因此从土壤中取样，先铲去表层土， 然后将样品装入事先准备好的信封中。 无菌操作 1、取土用的小铁铲的盛土样的信封在使用前都 需要灭菌。 2、应在火焰旁称取土壤。在火焰附近将称好的 土样倒入锥形瓶中，塞好棉塞。
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（2008天津31）． 莠去津在土壤中不易降解，为修复被其污 染的土壤，按下面程序选育能降解莠去津的细菌(目的菌)。已 知莠去津在水中溶解度低，含过量莠去津的固体培养基不透明
结论：
个平板的计数接近）。
重新实验。
结果的处理：
每克样品中的菌落数＝(C÷V)×M
其中，C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V代表涂布 平板时所用的稀释液的体积(ml)，M代表稀释倍数。
思考：实际统计的菌落数与活菌的实际数目什么关系，
为什么？
低。因为当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察 到的只是一个菌落。因此，统计结果一般用菌落数而不是 活菌数来表示。
培养液中缺少甲类细菌可利用的氮源或(和)有氧条件抑制了 甲类细菌的生长 . 25
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氮气 ； ③在固体培养基中，无透明带菌落利用的氮源主要是______ 莠去津 ，据此可筛选出目的 有透明带菌落利用的氮源主要是________ 菌。
实例分析1
第一位同学只涂布了一个平板，没有设置重复 说明设置重复组的重要性。在设计实验时，一定 组，因此结果不具有说服力。 为使结果接近真实值可将同一稀释度 要涂布至少 3个平板，作为重复组，才能增强实验的说服力 第二位同学考虑到设置重复组的问题，涂布了 加到三个或三个以上的平板中（平行重复原则）， 三个平板，但是其中 1个平板的计数结果与另外 2个 与准确性 。在分析实验结果时， 一定要考虑所设置的重复 相差太远，说明在操作过程中可能出现了错误，因 组的结果是否一致，结果不一致，意味着操作有误，需要 经涂布，培养计算出菌落平均数（其中至少要有两 此，不能简单地将3个平板的计数值用来求平均值。
课题2
土壤中分解尿素的细菌 的分离与计数
课题背景
1、尿素是一种重要的农业氮肥。尿素能被植物体直接 吸收吗？如果不能它怎么才能吸收N素？
土壤中的细菌将尿素分解成氨之后才能被植物利用
2、细菌能利用尿素的原因? 土壤中的细菌分解尿素是因为它们能合成脲酶 脲酶
3、常见的分解尿素的微生物 芽孢杆菌、小球菌、假单胞杆菌、克氏杆菌、棒状杆菌、 梭状芽孢杆菌，某些真菌和放线菌也能分解尿素。 4、学习目的：
将A同学配制的培养基在不加土样的情况下进行
思考：为了增强实验结果的说服力和准确性，我们
在实验设计时应该怎么做更合理？
遵循实验基本原则 1、平行重复原则 2、对照原则 3、单一变量原则
3、滤膜法
以测定饮用水中大肠杆菌的数目为例。将已知 体积的水过滤后，将滤膜放在伊红美蓝培养液基上 培养。在该培养基上，大肠杆菌的菌落呈现黑色。
(1)②中培养目的菌株的选择培养基中应加入______作为碳源，② 中不同浓度碳源的培养基______(A. 影响；B.不影响) 细菌的数量， 如果要测定②中活细菌数量，常采用______法。 (2)④为对照，微生物在④中不生长，在⑤中生长，④与⑤培养基 的主要区别在于 ______________ ；使用 ____________ 法可以在⑥ 上获得单菌落。采用固体平板培养细菌时进行倒置培养的原因是 _____________________________________。 (3)实验过程中如何防止其他微生物的污染？ __________________________________。
启示？
1、微生物应该在适应其生存的相应环境中去寻找
2、实验室筛选微生物应该人为提供有利于目的菌
株生长的条件（包括营养、温度、pH等），同时
抑制或阻止其他微生物生长。
选择培养基：
允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻
止其他种类微生物生长的培养基 思考：如何构建选择培养基？ 如何构建分离分解尿素的细菌的培养基？
操作成功
若选取同一种土样，统计结果应接近
课题延伸
方法：在以尿素为唯一氮源的培养基 中加入酚红指示剂，培养某种细菌后， 如果pH升高，指示剂将变红。
【例1】苯酚是工业生产排放的有毒污染物质，自然界中存在着
降解苯酚的微生物。某工厂产生的废水中含有苯酚，为了降 解废水中的苯酚，研究人员从土壤中筛选获得了只能降解利 用苯酚的细菌菌株，筛选的主要步骤如图所示，①为土壤样 品。请回答下列问题。
。据图回答：
自然选择 作用，在长期使用莠去津的土壤 ①由于莠去津的_________ 中可能含有目的菌。
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②下图是A—C瓶中三类细菌的最大密度柱形图。由图推断，从 A瓶到c瓶液体培养的目的是初步选择能降解莠去津的细菌(目的 苗)并提高其密度; 甲类细菌密度迅速降低的主要原因
资料三 微生物的培养与观察
培养不同微生物往往需要不同培养温度。
细菌：30～37℃培养1～2d 放线菌：25～28℃培养5～7d 霉菌：25～28℃的温度下培养3～4d。
在菌落计数时，每隔24h统计一次菌落数目。选取菌落 数目稳定时的记录作为结果，以防止因培养时间不足 而导致遗漏菌落的数目。
四.结果分析与评价
【变式】由于酵母菌利用淀粉的能力很弱，有人将地衣 芽孢杆菌的α-淀粉酶基因转入酵母菌中经筛选得到了可 高效利用淀粉的工程菌菌种（过程如图甲所示）。
α-淀粉酶基因 ① 接种 接种到新鲜培养基 ③ 选择、接种 ② 接种
重组质粒
工程酵母菌
固体平板培养
液体培养
菌种
图甲
图乙
源自文库
(1)图甲中，过程①需要的酶有_____________。为达到筛选目的 ，平板内的固体培养基应以____________作为唯一碳源。②、③过 程需要重复几次，目的是______________。 (2）某间学尝试过程③的操作，其中一个平板经培养后的菌落分 布如图乙所示。该同学的接种方法是_______________；推测该同 学接种时可能的操作失误是______________。 (3）以淀粉为原料，用工程酵母菌和普通酵母菌在相同的适宜条 件下密闭发酵，接种________菌的发酵罐需要先排气，其原因是 __________________________。
（1）从土壤中分离出能够分解尿素的细菌
CO(NH2)2 + H2O
2NH3 + CO2
（2）统计每克土壤样品中究竟含有多少这样的微生物
知识一 筛选菌株 思路：水生耐热细菌Taq ( Thermus aquaticus ) ——耐高温的Taq DNA聚合酶 美国微生物学科布鲁克1966年发现耐热细菌
内容 现象 对照的培养皿中无菌 落生长 结论 未被杂菌污染
有无杂菌污 染的判断
培养物中菌落数偏高
菌落形态多样，菌落 数偏高
被杂菌污染
培养物中混入其他杂菌
选择培养基 的筛选作用 样品的稀释 操作 重复组的结果
牛肉膏培养基上的菌 落数目大于选择培养 选择培养基具有筛选作用 基上的数目
得到二个或二个以上 菌落数目在30～300 的平板
个体小的细菌在显微镜下难以观察；
2.间接计数法（活菌计数法）
⑴原理：在稀释度足够高时，微生物在固体培养基上形成的一个 ⑵常用方法：稀释涂布平板法
恰当的稀释度、正确的涂布操作是成功地统计菌落数目的关键。
菌落是由一个单细胞繁殖而成的，即一个菌落代表原先一个单细胞。
为了保证结果准确，一般选择菌落数在30--300之间的平板计数。
以牛肉膏蛋白胨培养基接种相同微生物作为 对照组，与实验组比较生长微生物的菌落数量。
知识点二 微生物计数 1、显微镜直接计数法
1mm
下面以一个大方格有25个中方格的计数板为例进行计算：设五 个中方格中总菌数为A，菌液稀释倍数为B，那么1ml菌液中的 总菌数是多少?
缺点：不能区分死菌与活菌； 不适于对运动细菌的计数；
实例分析2
想一想：A同学和其他同学所得实验结果差异 如此之大，请分析原因可能有哪些？
①
②
一种方案： 可以由其他同学用与A同学一样的土样进行实验。 另一种方案：
如果结果与A同学一致，则证明A无误；
如果结果不同，则证明A同学存在操作失误或培养基的配制 培养，作为空白对照，以证明培养基是否受到污染。 有问题。