病毒宏基因组学
病毒宏基因组学在动物病毒研究中的应用及研究进展
技术，也能够得到很好的效果，先后推广向贵州省内的 其他多个地区和四川、重庆等地区，均表现出良好的适 应性能。黔北麻羊因以肉质优美、富含多种人体必需 氨基酸和不饱和脂肪酸，绿色环保，是新一代山羊品种 发展新方向。
２ 病毒宏基因组学的应用
病毒宏基因组学已经应用到人类、动物和环境中， 涉及到农业、工业及畜牧业等各个领域，其应用范围已 延伸到海洋、湖水、热泉、下水道等无机环境，以及组织 病料、血液、呼吸道、动物排泄物等有机环境［１６］。２００９ 年，Ｆａｎ等［１７］应用病毒宏基因组学的方法研究佛罗里 达绿海龟的纤维状乳头瘤组织中发现了新型单链 ＤＮＡ 病毒（Ｓｅａｔｕｒｔｌｅｔｏｒｎｏｖｉｒｕｓ１，ＳＴＴＶ１）。２００９年，Ｄｊｉｋｅｎｇ 等［１８］系统分析了来自马里兰淡水湖中的 ＲＮＡ病毒宏 基因组，结果获得淡水湖中 ３０多个 ＲＮＡ病毒家族序 列，其中包含小 ＲＮＡ病毒、小双股病毒及正黏病毒等。 ２００９年，Ｗｉｌｌｎｅｒ等［１９］研究了健康和呼吸道感染的人的 呼吸道分泌物中的 ＤＮＡ病毒群落。发现肺囊性纤维 化病人的病毒群体包括疱疹病毒和反转录病毒等，而 健康人的病毒群落呈现出明显的多样性。２０１０年，Ｄａｙ 等［２０］应用病毒宏基因组学分析患有肠道病毒性肠炎 的火鸡群，结果显示火鸡肠道内含有呼肠孤病毒、小 ＲＮＡ病毒及星状病毒等。Ｓｈａｎ等［２１］对中国 １７份猪粪 便研究也获得了猪肠道病毒组的构成，包括肠道病毒、 博卡病毒和星状病毒等。蝙蝠作为很多人兽共患病 （例如埃博拉病毒、严重急性呼吸系统综合征（ＳＡＲＳ） 病毒和尼帕病毒）的自然传播宿主，故蝙蝠体内的病毒 多样 性 成 为 学 者 研 究 的 热 点。２０１０年，Ｌｉ等［２２］和 Ｄｏｎａｌｄｓｏｎ等［２３］应用病毒宏基因组学的方法分别研究 了北美蝙蝠粪便中的病毒群落。发现了大量新的哺乳 动物病毒和昆虫病毒及植物病毒，Ｄｏｎａｌｄｓｏｎ还发现了 一株新的冠状病毒。Ｇｅ等［２４］和 Ｗｕ等［２５］也采用类似 的技术对不同地方的蝙蝠进行研究，发现了一些蝙蝠 圆环病毒、蝙蝠腺病毒、蝙蝠博卡病毒和蝙蝠乳头瘤病 毒等病毒。２０１３年，杨凡力等［２６］应用病毒宏基因组学 的方法研究吉林、云南、湖南采集的蝙蝠组织，发现蝙 蝠体内有细小病毒、博卡病毒、腺病毒、小双节 ＲＮＡ病 毒、圆环病毒等新病毒。
宏基因组学的PPT
宏基因组学的PPT宏基因组学是通过收集宿主的粪便里的微生物、以及培养皿中的微生物，利用专业的宏基因组技术进行分析。
它能够获得宏基因组信息和相关序列，从而为疾病相关症状的诊断和治疗提供依据。
随着人类健康问题愈演愈烈，为了降低成本，并能通过生物技术进行治疗，研究人员开发了宏基因组学技术。
其通过收集环境中存在的特定细菌，来分析它们在土壤、水源或大气中的分布，以了解它们在整个生态系统中所扮演的角色。
宏基因组学（宏测序法）是一种对人体和环境进行科学评价（包括微生物菌群与疾病之间关系）的工具。
它是一种高通量方法来鉴定微生物群落或疾病（包括寄生虫病等),并用于进行疾病和环境健康状态跟踪和诊断。
虽然宏基因组学可以通过分析病原体来诊断疾病——但目前还没有针对特定微生物群落或某一种病原体开展研究。
1.目的宏基因组学通过收集宿主的粪便和排泄物，以及在培养皿或土壤中的特定微生物群落来检测微生物菌群。
它们在宿主的整个生命周期中都是重要的，并且是许多宿主健康相关问题发生和治疗的潜在因素之一。
通过对宿主宏基因组学数据进行统计分析，可以更好地了解宿主微生物多样性与环境健康状况之间的关系；进而有助于了解宿主肠道微生物及其他微生物群落对人体健康所发挥作用；同时也有助于了解特定微生物群落与其健康状况之间的关系。
此外，还可以通过研究宿主体内微生物种群之间互相作用机制，从而更好地理解宿主微生物群落结构及疾病发生背后原因。
这为人类健康提供了新的见解。
在环境方面，宏基因组学可以从宿主微生物群落中发现与生态系统结构相关、通过检测宿主体内微生物群落来揭示生命现象本质和机制；还可以通过感染或死亡微生物群落以及与宿主相互交互作用规律来揭示微生物群落与疾病发生之间关系：同时宏基因组学还可以为相关研究人员提供研究资源、为治疗提供科学依据。
此外，宏基因组学还能为环境健康状态跟踪和诊断提供参考——为了解环境健康状态和健康风险提供科学依据。
2.方法原理在了解宿主肠道中的微生物群落的组成之后，宏基因组学可以分析宿主的粪便样本。
宏基因组rc
宏基因组rc
宏基因组学是研究直接从环境或临床样本中回收遗传物质的研究领域，也被称作环境基因组学、生态基因组学、群落基因组学或微生物组学。
宏基因组研究本质上还是微生物学研究，只是传统微生物学研究的一个扩展。
所以研究目的与其他生物学研究类似，同样是关注基因型、表型与环境之间的相互关系以及相互作用，不过微生物与环境之间有更强的相互作用关系。
具体来说，宏基因组学的研究目的包括：
1. 定性分析：确定样品中包含哪些微生物，如原核生物、真菌、病毒、显微藻类、原生动物等。
2. 定量分析：分析不同微生物之间的丰度，即样品中每种微生物所占的比例，并探索这些比例变化与表型之间的关联。
3. 功能分析：检测样品中包含哪些基因，以及这些基因实现哪些代谢功能。
将整个样品当做一个基因集合，对这些基因的功能和代谢进行分析。
4. 比较分析：研究不同样品之间的差异，包括它们包含的微生物种类、基因和代谢功能等方面的差异。
以上信息仅供参考，如果您想了解更多信息，建议查阅相关文献或咨询专业人士。
宏基因组学的原理及应用
宏基因组学的原理及应用1. 简介宏基因组学是研究宏生物结构与功能之间关系的学科，它通过对生态系统中的微生物群落进行高通量测序分析，揭示微生物群落的组成、功能和相互关系。
宏基因组学是基因组学的一个分支领域，其发展得益于高通量测序技术的快速发展和大数据分析的进步。
2. 宏基因组学的原理宏基因组学的研究主要基于以下两个原理：2.1 16S rRNA测序16S rRNA是细菌和古菌中高度保守的基因，在细菌的核糖体上起到了支持核糖体结构和功能的重要作用。
通过对16S rRNA基因进行测序，可以获得微生物群落中不同菌株的信息。
在宏基因组学中，常用的方法是对16S rRNA基因的V3-V4区域进行PCR扩增，然后使用高通量测序技术进行测序。
2.2 基因功能注释除了对微生物群落的组成进行研究外，宏基因组学还关注微生物群落的功能。
基因功能注释是指根据DNA序列，通过比对到已知的基因库，预测DNA序列可能对应的功能。
这种方法可以通过分析微生物群落中不同基因的相对丰度，进一步推断微生物群落的功能。
3. 宏基因组学的应用宏基因组学在生态学、环境科学、医学等领域有着广泛的应用：3.1 生态系统研究宏基因组学可以揭示不同生态系统中微生物群落的组成与功能，帮助我们了解生态系统中的物种多样性和生态过程。
通过研究微生物群落的分布和相互作用，宏基因组学可以促进生态学的发展，并为生态系统的保护和管理提供科学依据。
3.2 环境监测宏基因组学可以应用于环境监测，帮助我们了解环境中的微生物群落变化及其对环境污染的响应。
通过对微生物群落的分析，可以监测水体、土壤和空气中的微生物污染源，并预测环境变化对微生物群落结构和功能的影响。
3.3 人体微生物组研究宏基因组学在医学领域有着重要的应用，特别是在人体微生物组研究中。
人体微生物组是指人体内的所有微生物群落，包括皮肤、口腔、肠道等。
通过对人体微生物组的研究，可以深入了解人体健康和疾病之间的关系，为疾病的预防和治疗提供依据。
宏基因组 基因功能标准化
宏基因组通常指的是对某一环境中所有微生物（包括细菌、真菌、病毒等）的基因组的总体研究。
基因功能标准化是指在宏基因组学研究中对基因功能进行一致性和标准化的定义、描述和解释。
这包括以下几个方面：
1. 基因注释：将基因与已知的生物学功能、通路、代谢途径等信息相关联。
这有助于更好地理解宏基因组中的生物多样性，并识别具有特定功能的基因。
2. 功能注释的一致性：在宏基因组学研究中，由于研究样本的多样性，不同环境中的微生物群体可能具有差异的基因功能。
因此，需要确保对不同环境中的基因功能进行一致性的描述和解释。
3. 元数据的标准化：元数据是指描述宏基因组样本的信息，如样本来源、采集时间、地理位置等。
标准化元数据有助于比较不同研究中的宏基因组数据，从而更好地理解生态系统的差异。
4. 通用数据库：建立通用的宏基因组数据库，整合不同研究团队的数据，并提供标准化的查询和分析工具。
这有助于促进跨学科的研究和数据共享。
5. 标准化分析流程：制定宏基因组数据分析的标准化流程，确保不同研究组织和实验室之间的数据处理结果是可比较的。
在实际研究中，宏基因组学的标准化可以促进对微生物丰度、群落结构和功能潜力的更准确、可靠和可比较的解释。
这对于理解微生物在不同环境中的角色、功能和相互作用至关重要，对于生态学、环境科学和医学等领域都具有重要的意义。
标准化有助于确保宏基因组学研究的可重复性，进而推动对微生物世界的更深层次的认知。
宏基因组的优点
宏基因组的优点：
宏基因组学研究在多个领域有着广泛的应用，其优点主要包括以下几点：
1.不依赖于传统培养技术：传统的微生物培养方法依赖于特定培养条件，而宏基因组
学技术可以直接对环境样本进行测序，无需进行培养，因此可以检测到那些难以培养的微生物物种。
2.全面揭示微生物多样性：宏基因组学能够全面揭示环境中的微生物多样性，包括细
菌、真菌、病毒等，有助于深入了解微生物群落的生态结构和功能。
3.无需进行物种鉴定：通过对环境样本进行高通量测序，可以直接获得微生物群落的
基因信息，无需进行繁琐的物种鉴定，使得研究过程更加简便。
4.可应用于各种环境样本：宏基因组学技术可以应用于各种环境样本，如土壤、水体、
人体肠道等，从而实现对不同环境中微生物群落的研究。
5.有助于发现新的生物资源和药物：通过宏基因组学研究，可以发现一些具有重要应
用价值的微生物物种，如新的生物催化剂、生物农药等，同时也有助于发现新的药物。
6.揭示微生物群落与环境之间的相互作用：通过宏基因组学研究，可以深入了解微生
物群落与环境之间的相互作用，如微生物对环境变化的响应机制等，有助于预测和控制环境污染等方面的问题。
病毒宏基因组学方法优缺点及意义
病毒宏基因组学方法优缺点及意义病毒宏基因组学方法优缺点及意义随着时代的发展和生物科学技术的进步，新兴的病毒宏基因组学为解决这些问题提供了契机，以下是一篇关于病毒宏基因组学探究的论文范文，供大家阅读参考。
病毒个体微小，多数病毒直径在100nm(20~200nm)，较大的病毒直径300~450nm,较小仅为18~22nm,结构简单，不能独立复制需要依赖于宿主细胞复制繁殖，被许多生物学家认为是处于生命和非生命交叉区域的存在物。
据估计目前对病毒的发掘还不到1%[1],对病毒的研究具有广阔的前景和现实意义。
病毒独特的结构和特性给病毒的研究和鉴别带来许多困难，主要体现在两个方面：第一，病毒没有专门的宿主细胞系，60%以上的病毒无法成功的进行离体培养[2]或在培养中不能表达致病性;第二，病毒基因本身变异率高，通过与宿主间的相互作用进化，增加核酸多样性，产生新病毒，导致宿主范围扩大、跨物种传播[3].对细菌的研究可以通过保守的16sRNA的分析来定位分类信息、进化关系和种群多样性等。
对于真菌有18sRNA及ITS序列。
然而病毒不像细菌真菌，没有固定保守的进化标记基因。
所以一些传统研究方法的应用受到限制，不能完全满足病毒研究的需要。
如电镜观察病毒的灵敏性不高，细胞培养病毒可能观察不到细胞病变，血清学反应中不但难以获得高价抗体而且容易出现交叉反应导致错误结果，传统PCR方法对未知序列及高变异的病毒研究难以发挥作用。
加之近年来病毒流行病的频繁发生及其可怕的传染性，对人类及动植物的健康产生严重威胁，如HIV病毒、SARS病毒、禽流感病毒和在西非等地肆虐的埃博拉病毒[4]等，给人们造成了巨大的恐慌和经济损失。
因此，对病毒基因组的研究、致病源的探索、病毒在生物体和环境中如何存在及传播、病毒病防治的研究已迫在眉睫。
随着时代的发展和生物科学技术的进步，新兴的病毒宏基因组学为解决这些问题提供了契机，宏基因组学(Metagenomics)的概念是1998年由Handelsman[5]首次提出，对特定环境中基因组的总和进行研究，包括培养的和未培养的.微生物。
养殖对虾的病毒宏基因组分析及虾血细胞虹彩病毒(Shrimp hemocyte iridescent virus,SHIV)的分子流行病学
养殖对虾的病毒宏基因组分析及虾血细胞虹彩病毒（Shrimp hemocyte iridescent virus,SHIV）的分子流行病学研究对虾是世界水产养殖业当中重要的经济品种,是深受消费者喜爱的高品质水产品。
尤其是在一些沿海发展中国家,对虾养殖既提供了国民生存所需的基本蛋白源,又创造了巨大的经济效益。
而对虾养殖在我国同样具有重要的地位,早在上世纪七十年代,我国便开展了中国对虾的人工育苗工作,八十年代形成规模化的养殖,在经历了虾病大爆发后引进了凡纳滨对虾,之后稳步提升,到现在我国已经成为世界上最大的对虾养殖国家,海水养殖面积达到23万公顷,育苗超过1万亿尾。
但即便如此,我国每年仍需进口大量对虾来满足国内的消费需求。
而1993年以后,病害问题层出不穷,已知病原的持续传播,新发疫病的频繁暴发,屡屡给产业带来严重的损失,使产业和养殖环境面临巨大的挑战。
而对虾的病毒病因其发病迅速,传播能力强,宿主宽泛,又无明确的防治办法,对产业的影响尤为严重。
新发病原因为生物学特性、感染方式的不确定,同时因为传统病毒学研究手段的局限,给新病原的及时发现与防控带来了极大的挑战。
对于未知病毒的挖掘,目前只能依靠电子显微镜的观察,这种通过形态观察来辨别新病毒的方式难度较大,准确性差。
即使观测到病毒颗粒,也无法准确判断病毒的分类,难以得到病毒的核酸序列,给进一步的研究带来困难。
病毒宏基因组学是研究病毒组成的一种新技术,在病毒(已知或未知)的及时发现与动态监测等方面具有突出的优势。
此技术已经在人类医学,兽医领域以及一些水产鱼类上得到了应用,但对虾病害的研究当中却鲜有相关报道。
本文首次对国内发病的养殖对虾样品进行病毒宏基因组学的处理和测序,探究发病对虾样品中病毒的组成情况。
从测序数据中挖掘出疑似致病性的对虾病毒,并针对单个病毒进行病原的分离鉴定,探究新病毒与对虾病症的关系。
同时,调查新病毒的感染和流行情况,为对虾养殖业中这些未知病原的防控提供理论基础。
病毒宏基因组测序
40
Eukaryotic DNA viruses
No. of samples
30
20
10
0
Unclass. ABneeAtallloptovhriarqiGtduoaaermeqviumrueCUasviMtrinrocucaorlssqvatuisarseud.vseCinriurocsvoivruiBrBsaiedbgaueoUvminruocGslvaMyiUsrrusoan.ssvcPtilrroaNueslvsyasion.ruGmosveaimBrvuoiirsncidaivapierairdvaoevirus
病毒宏基因组测序又称宏病毒组（Virome），是在宏基因组学理论的基础上，结合现有的病毒分子生物学检测技术而兴起的一个新的学科分支。宏
病毒组直接以环境中所有病毒的遗传物质为研究对象，能够快速准确的鉴定出环境中所有的病毒组成，在病毒发现、病毒溯源、微生物预警等研究方面具 测序策略与深度
分析内容
项目周期
病毒宏基因组测序
自然群体
DNA/cDNA总量≥3ug，浓度≥50ng/ul，无降解，无粘稠、无颜色异常，无RNA/蛋白质污染； 干冰寄送，使用无DNase管子存放，标记清晰。
（病毒富集、核酸提取和反转录、随机扩增可参考raw data
集数据库比对 基于reads的整合注释
多样本标准分析 丰度热图
主成分分析 聚类分析
显著性差异分析
35～75个自然日
案例解析
［案例一］ 针对炎症性肠病病毒基因组变化的研究[1]
本研究对剑桥、芝加哥、洛杉矶三个地区感染炎症性肠病（IBD）的人 群及其健康家属的粪便进行高通量测序，结果显示：在三组人群中有尾 目噬菌体和小噬菌体科物种相对丰度最高，并且两种病毒相对丰度呈负 相关趋势。比较剑桥地区IBD样本与对照，揭示了噬菌体丰度不成比例 主要与IBD有关，并初步验证肠病毒与IBD有关。
宏基因组学技术分析山羊瘤胃病毒的多样性
畜牧兽医学报 2023,54(7):2932-2941A c t a V e t e r i n a r i a e t Z o o t e c h n i c a S i n i c ad o i :10.11843/j.i s s n .0366-6964.2023.07.024开放科学(资源服务)标识码(O S I D ):宏基因组学技术分析山羊瘤胃病毒的多样性吴祎程1,2,冉 涛3,4*,周传社1,2*,谭支良1,2(1.中国科学院亚热带农业生态研究所亚热带农业生态过程重点实验室畜禽养殖污染控制与资源化技术国家工程实验室湖南省动物营养生理与代谢过程重点实验室农业部中南动物营养与饲料科学观测实验站,长沙410125;2.中国科学院大学,北京100049;3.兰州大学草地农业科技学院,兰州730020;4.兰州大学草种创新与草地农业生态系统全国重点实验室,兰州730020)摘 要:反刍家畜瘤胃内微生物丰富多样,病毒(主要是噬菌体)亦是其重要组成部分㊂瘤胃内所有的病毒可统称为瘤胃病毒组(r u m i n a l v i r o m e ),可以利用宏基因组学(m e t a ge n o m i c s )技术进行研究㊂解析山羊瘤胃病毒组的组分及功能有望更全面地了解其在瘤胃微生态区系中的地位和作用㊂为使测序结果能覆盖瘤胃中绝大部分病毒群落,不仅在样品的预处理阶段要尽量避免病毒样颗粒的损失,而且要保证瘤胃病毒组总D N A 的提取质量和产量均满足宏基因组测序的要求㊂本研究比较了制备瘤胃液病毒组分的4种流程:(P 1)离心+稀释㊁(P 2)离心+稀释+过滤㊁(P 3)离心+稀释+过滤+聚乙二醇沉淀㊁(P 4)离心+稀释+过滤+聚乙二醇沉淀+氯仿处理㊂提取核酸后采用I l l u m i n a N o v a s e q 6000平台对瘤胃病毒基因组D N A 进行测序,并对病毒群体结构进行分析比较,以筛选出瘤胃病毒组样品制备的最优流程㊂结果表明,聚乙二醇沉淀有助于病毒核酸提取,而氯仿处理过度影响病毒组分产量;山羊瘤胃内病毒群落主要是尾状病毒目的长尾病毒科㊁肌尾病毒科和短尾病毒科噬菌体㊂研究结果为深入分析噬菌体在山羊瘤胃微生态区系中的作用奠定了基础㊂关键词:瘤胃病毒;病毒宏基因组学;高通量测序技术;D N A 提取;多样性中图分类号:S 852.65 文献标志码:A 文章编号:0366-6964(2023)07-2932-10收稿日期:2022-08-30基金项目:国家自然科学基金(U 20A 2057);兰州大学 双一流 建设人才项目(561120213)作者简介:吴祎程(1997-),女,湖北武汉人,硕士生,主要从事瘤胃环境病毒提取及功能研究,E -m a i l :w u y i c h e n g19@m a i l s .u c a s .a c .c n ,T e l :0731-*********通信作者:周传社,主要从事反刍家畜蛋白质营养调控与农牧复合生态系统研究,E -m a i l :z c s @i s a .a c .c n ;冉 涛,主要从事传统动物营养学㊁分子营养学及胃肠道微生物组学研究,E -m a i l :r a n t @l z u .e d u .c nE v a l u a t i o n o f t h e V i r a l C o m m u n i t y C o m po s i t i o n i n G o a t R u m e n F l u i d ,B a s e d o n M e t a g e n o m i c A n a l ys i s WU Y i c h e n g 1,2,R A N T a o 3,4*,Z HO U C h u a n s h e 1,2*,T A N Z h i l i a n g1,2(1.S o u t h C e n t r a l E x p e r i m e n t a l S t a t i o n o f A n i m a l N u t r i t i o n a n d F e e d S c i e n c e i n t h e M i n i s t r y o fA g r i c u l t u r e ,H u n a n P r o v i n c i a l K e y L a b o r a t o r y o f A n i m a l N u t r i t i o n a l P h y s i o l o g y an d M e t a b o l i c P r o c e s s ,N a t i o n a l E n g i n e e r i n g L a b o r a t o r y fo r P o l l u t i o n C o n t r o l a n d W a s t e U t i l i z a t i o n i n L i v e s t o c k a n d P o u l t r y P r o d u c t i o n ,K e y L a b o r a t o r y f o r A g r o -E c o l o gi c a l P r o c e s s e s i n S u b t r o p i c a l R e g i o n ,I n s t i t u t e o f S u b t r o p i c a l A g r i c u l t u r e ,C h i n e s e A c a d e m y o f Sc i e n c e s ,C h a n g s h a 410125,C h i n a ;2.U n i v e r s i t y o f C h i n e s e A c ade m y of S c i e n c e s ,B e i j i ng 100049,Chi n a ;3.C o l l e g e o f P a s t o r a l A g r i c u l t u r e S c i e n c e a n d T e c h n o l o g y ,L a n z h o u U n i v e r s i t y ,L a n z h o u 730020,C h i n a ;4.S t a t e K e y L a b o r a t o r y o f H e r b a g e I m p r o v e m e n t a n d G r a s s l a n d A g r o -e c o s ys t e m s ,L a n z h o u U n i v e r s i t y ,L a n z h o u 730020,C h i n a )7期吴祎程等:宏基因组学技术分析山羊瘤胃病毒的多样性A b s t r a c t:V i r u s e s,m a i n l y b a c t e r i o p h a g e,a r e s i g n i f i c a n t c o m p o n e n t s o f t h e r u m i n a l m i c r o b i o t a i n r u m i n a n t s.A l l t h e r u m i n a l v i r u s e s a r e c a l l e d r u m i n a l v i r o m e,a n d c o u l d b e s t u d i e d b y m e t-a g e n o m i c s.U n d e r s t a n d i n g t h e c o m p o n e n t s a n d f u n c t i o n s o f g o a t r u m i n a l v i r u s e s i s e x p e c t e d t o p r o v i d e a m o r e c o m p r e h e n s i v e u n d e r s t a n d i n g o f r u m e n m i c r o e c o l o g y.A c c u r a t e p r o f i l i n g o f c o m-p l e x r u m e n v i r o m e r e q u i r e s D N A e x t r a c t i o n m e t h o d s t h a t p r o v i d e a d e q u a t e q u a l i t y a n d q u a n t i t y, a s w e l l a s s u f f i c i e n t c o v e r a g e o f t h e o r i g i n a l c o mm u n i t y.I n t h i s s t u d y,f o u r p r o c e d u r e s t o e x t r a c t v i r u s e s-l i k e p a r t i c l e s(V L P s)f r o m r u m e n f l u i d w e r e c o m p a r e d:(P1)c e n t r i f u g a t i o n+d i l u t i o n, (P2)c e n t r i f u g a t i o n+d i l u t i o n+f i l t r a t i o n,(P3)c e n t r i f u g a t i o n+d i l u t i o n+f i l t r a t i o n+p o l y-e t h y l e n e g l y c o l(P E G)p r e c i p i t a t i o n,(P4)c e n t r i f u g a t i o n+d i l u t i o n+f i l t r a t i o n+P E G p r e c i p i-t a t i o n+c h l o r o f o r m t r e a t m e n t.T h e n u c l e i c a c i d i n f o u r p r o c e d u r e s w a s e x t r a c t e d a n d D N A c o n-c e n t r a t i o n,p u r i t y a n d i n t e g r i t y w e r e c o m p a r e d.T h e n g e n o m i c D N A s e q u e n c i n g w a s p e r f o r m e d u s i n g I l l u m i n a N o v a s e q6000a n d v i r u s p o p u l a t i o n s t r u c t u r e w a s a n a l y z e d.T h e r e s u l t s s h o w e d t h a t t h e r e w e r e p o s i t i v e e f f e c t s o f f i l t r a t i o n a n d P E G p r e c i p i t a t i o n o n v i r a l n u c l e i c a c i d q u a l i t y. T h e c h l o r o f o r m t r e a t m e n t,s e v e r e l y r e d u c i n g v i r u s-l i k e p a r t i c l e s(V L P s)y i e l d,s h o u l d b e u s e d w i t h c a u t i o n w h e n p e r f o r m i n g h i g h-t h r o u g h p u t s e q u e n c i n g.T h e v i r a l c o mm u n i t i e s i n t h e r u m e n w e r e d o m i n a t e d b y b a c t e r i o p h a g e s b e l o n g i n g t o t h e v i r a l o r d e r C a u d o v i r a l e s(i.e.,M y o v i r i d a e, P o d o v i r i d a e,a n d S i p h o v i r i d a e).T h e r e s u l t s p r o v i d e t h e b a s i s f o r f u t u r e i n v e s t i g a t i o n s r e g a r d i n g t h e e c o l o g i c a l i m p o r t a n c e o f v i r u s e s i n r u m e n m i c r o b i a l e c o s y s t e m s.K e y w o r d s:r u m e n v i r u s;v i r a l m e t a g e n o m i c s;h i g h-t h r o u g h p u t s e q u e n c i n g t e c h n o l o g y;D N A e x-t r a c t i o n;d i v e r s i t y*C o r r e s p o n d i n g a u t h o r s:Z HO U C h u a n s h e,E-m a i l:z c s@i s a.a c.c n;R A N T a o,E-m a i l:r a n t@ l z u.e d u.c n反刍家畜瘤胃是一个复杂且多样的微生态系统,其内栖息了细菌㊁真菌㊁原虫㊁古生菌和病毒等多种微生物,瘤胃内病毒主要由噬菌体(b a c t e r i o-p h a g e)构成[1]㊂在微生物生态系统中,病毒尤其是噬菌体的侵染作用会极大地影响微生物群落的结构及功能[2]㊂但由于病毒基因组缺乏合适标记基因和分析基准,且多数病毒无法被归类或找到对应宿主,因此,难以通过P C R等常规技术来检测未知病毒序列[3],以致病毒组研究相对滞后㊂近年来,宏基因组学和生物信息学的发展极大地促进了宏病毒组的研究,并已应用于研究不同环境样本中的病毒群落,如海洋[4]㊁土壤[5]㊁人类粪便[6]等㊂研究人员很早便关注瘤胃液中的病毒群落,陆续分离鉴定了多种瘤胃噬菌体,包括以坏死梭杆菌(F u s o b a c t e r i u m n e c r o-p h o r u m)㊁白色瘤胃球菌(R u m i n o c o c c u s a l b u s)㊁溶纤维丁酸弧菌(B u t y r i v i b r i o f i b r i s o l v e n s)和瘤胃拟杆菌(P r e v o t e l l a r u m i n i c o l a)等为宿主菌的10种噬菌体[7]㊂但是,目前仍缺乏对瘤胃病毒群落的整体认知㊂宏病毒组测序的关键在于从待测样品中富集病毒组分(v i r u s-l i k e p a r t i c l e s,V L P s),获取高质量的病毒核酸用于宏基因组测序㊂已有研究发现,D N A 病毒占据了病毒的绝大部分,本研究仅关注D N A 病毒㊂由于病毒的基因组非常小,如果直接对样品中所有的微生物组D N A进行宏基因组测序,虽然能够获得部分病毒的基因序列,但是容易丢失那些读长短㊁丰度低的病毒序列,不能真实反映病毒的群体构成[8]㊂同时,病毒组分中的噬菌体具有溶源性㊁溶菌性和慢性感染等生命周期,其中溶源性噬菌体在溶源性周期中将遗传物质整合到其细菌宿主的基因组中[9],通过生物信息学分析可以从细菌宏基因组数据中挖掘到溶源性噬菌体的基因序列,但是不能有效获取仅有溶菌性周期的噬菌体㊂因此,V L P s 的富集对全面解析样品中游离病毒组分尤为重要㊂由于瘤胃液样本具有特殊性,如存在饲料大颗粒㊁厌氧环境㊁中性偏酸环境,因此有必要建立专门的瘤胃病毒颗粒分离方法[10]㊂理想情况下,该方法应能快速㊁高效获得病毒组分,易于在实验室中操作㊂氯化铯(C s C l)密度梯度离心是病毒浓缩和纯化的常用技术之一,但是该方法需要用到超速离心3392畜牧兽医学报54卷机,不仅价格昂贵,而且操作耗时较长,更重要的是可能导致大量病毒组分的损失[11]㊂氯仿处理被认为是一种可代替C s C l密度梯度离心的快速纯化病毒的方法,其可通过破坏细菌的胞膜结构,以达到有效去除细菌的效果[12]㊂鉴于此,本研究在提取瘤胃液病毒组分基因组D N A之前,参考C a s t r o-M e jía 等[13]对人粪便样品采用的聚乙二醇(P E G8000)沉淀法,设计4种流程瘤胃液病毒组分富集流程: (P1)离心+稀释㊁(P2)离心+过滤+核酸酶处理㊁(P3)离心+稀释+过滤+聚乙二醇沉淀㊁(P4)离心+稀释+过滤+聚乙二醇沉淀+氯仿处理㊂P E G 8000广泛应用于病毒(噬菌体)的纯化过程,可使病毒沉淀,而不受其他有机质的干扰㊂本研究旨在比较过滤㊁P E G沉淀以及氯仿处理对瘤胃液样品中游离病毒组分D N A质量(产量㊁纯度和完整性)的影响,并利用I l l u m i n a N o v a s e q6000平台对获得的瘤胃病毒基因组D N A进行测序,通过对瘤胃病毒群体结构进行分析来评价不同流程对瘤胃病毒组分富集的效果,以期为进一步研究瘤胃病毒功能提供技术支撑㊂1材料与方法所有动物程序均遵循动物护理和使用指南,并经中国科学院亚热带农业研究所动物护理委员会批准(批准号I S A-W-201609)㊂选用3只体重相近((31.13ʃ3.72)k g)㊁体况良好的成年雄性湘东黑山羊作为试验动物,安装永久性瘤胃瘘管,按本团队成员曾波等[14]的报道进行术后护理和饲喂㊂试验羊的基础日粮由52%玉米秸秆㊁21.52%玉米㊁16.96%麦麸㊁5.98%豆粕㊁0.86%菜籽饼㊁1.08%尿素㊁0.60%食盐以及1%预混料组成㊂日粮营养水平为10.72%粗蛋白㊁58.76%中性洗涤纤维以及27.79%酸性洗涤纤维㊂1.1瘤胃液样品采集步骤山羊晨饲后4h,通过瘤胃瘘管采集瘤胃内容物,用无菌搅拌棒搅动使瘤胃内容物样品混匀,经4层无菌纱布过滤至50m L无菌离心管,离心管装至2/3处后立刻盖严,投入液氮罐中速冻,置于干冰上迅速转移至实验室,于-80ħ冰箱中保存备用㊂1.2瘤胃液病毒组分制备试验流程参考C a s t r o-M e jía的方法[13],并加以修改,以有效分析瘤胃液病毒组㊂为消除动物个体差异,将3头黑山羊的瘤胃液等体积混合,分成3份,操作流程如图1所示㊂离心:将解冻瘤胃液在4ħ下以5000ˑg离心15m i n,将液体部分转移至新的无菌离心管中,以去除瘤胃液样品中的饲料残渣;接着在4ħ下以15000ˑg转速离心30m i n,以去除其他小颗粒碎片,收集上清液㊂稀释:将上述含有游离病毒样颗粒的上清液与预冷的S M缓冲液(200m m o l㊃L-1N a C l,10m m o l㊃L-1 M g S O4,50mm o l㊃L-1T r i s p H7.5)进行1ʒ2稀释㊂过滤:通过1.0μm的玻璃纤维滤纸(W h a t-m a n,G F/C,U K)过滤,以去除瘤胃液中的粒径较大的细菌㊁原虫等,随后经过孔径为0.45μm的P V D F无菌滤膜(M i l l i p o r e B i l l e r i c a,MA,U S A)过滤,进一步去除细菌等㊂P E G沉淀:将200g P E G8000与146.1g N a C l 溶于1L蒸馏水中,经高压蒸汽灭菌后获得P E G-N a C l溶液㊂将过滤步骤后得到的上清液转移到新离心管中,向每个样品中加入25%(v/v)的P E G-N a C l溶液,于4ħ下震荡孵育22h,孵育结束后将样品于4ħ㊁13000ˑg离心45m i n,弃上清,沉淀即为病毒组分,并将其溶解于1m L预冷的0.01m o l㊃L-1磷酸盐缓冲液(P B S)中㊂氯仿处理:向获得的病毒组分浓缩液中加入等体积的氯仿,涡旋1m i n,使氯仿与样品均匀混合,形成乳状物,于4ħ㊁15000ˑg离心5m i n,小心吸取上清液至新的无菌离心管,即为病毒组分㊂1.3瘤胃液基因组D N A提取核酸酶处理:在提取D N A之前,用1.25μL D N a s e I和1.25μL R N a s e A处理样品30m i n,以消除游离D N A和R N A污染,随后在37ħ水浴中孵育10m i n,接着加入1μL100mm o l㊃L-1E D T A 使核酸酶失活,最后在65ħ下水浴孵育10m i n终止E D T A反应㊂使用D N A提取试剂盒(O m e g a D3892-01V i r a l D N A K i t,U S A)提取制备的瘤胃液病毒组分样品的核酸,提取步骤严格按照试剂盒说明书进行㊂完成病毒基因组D N A抽提后,使用Q u b i t D N A广谱分析仪(T h e r m o F i s h e r S c i e n t i f-i c)测定浓度㊁O D260n m/280n m及O D260n m/230n m,并使用1.0%(w/v)琼脂糖凝胶电泳检测基因组D N A的完整性㊂提取的D N A样品储存在-20ħ,直至文库制备及测序㊂检测合格的D N A样品采用C o v a-r i s M220超声破碎仪将样品D N A随机打断成长度43927期吴祎程等:宏基因组学技术分析山羊瘤胃病毒的多样性将瘤胃液混合后,分成三份按照四组流程进行处理,命名为P 1至P 4,下同㊂步骤1(离心)㊁2(稀释)为所有流程的共同步骤,且P 1只执行步骤1和2,P 2执行步骤1㊁2和3(微孔滤膜过滤),P 3执行步骤1㊁2㊁3和4(聚乙二醇沉淀),P 4执行步骤1㊁2㊁3㊁4和5(氯仿处理)T h e r u m e n f l u i d o f t h r e e g o a t s w e r e c o l l e c t e d a n d m i x e d ,t h e n d i v i d e d i n t o t h r e e p a r t s a n d p r o c e s s e d a c c o r d i n gt o f o u r r o u t e s n a m e d P 1t o P 4,t h e s a m e a s b e l o w.S t e p s 1(c e n t r i f u g a t i o n )a n d 2(d i l u t i o n )a r e t h e c o mm o n s t e p s o f a l l pr o c e s s e s ,a n d P 1o n l y p e r f o r m s s t e p s 1a n d 2,P 2p e r f o r m s s t e p s 1,2a n d 3(m i c r o p o r o u s m e m b r a n e f i l t r a t i o n ),P 3p e r f o r m s s t e ps 1,2,3a n d 4(P E G p r r e c i p i t a t i o n ),a n d P 4p e r f o r m s s t e ps 1,2,3,4a n d 5(c h l o r o f o r m t r e a t m e n t )图1 从山羊瘤胃液中分离富集病毒组分的流程示意图F i g .1 S c h e m a t i c r e pr e s e n t a t i o n o f t h e p r o c e d u r e s f o r t h e e x t r a c t i o n o f v i r u s e s f r o m g o a t r u m e n f l u i d 约为450b p 的片段,经末端修复㊁加入A 尾㊁加测序接头㊁纯化㊁P C R 全基因组扩增等步骤完成文库制备,质检合格的文库将采用I l l u m i n a N o v a s e q 6000平台进行测序(上海凌恩生物技术有限公司)㊂1.4 数据质控由于I l l u m i n a N o v a s e q 6000的原始测序数据中包含测序接头序列㊁低质量读段㊁N 率较高序列及长度过短序列,这将严重影响后续组装的质量㊂为保证后续的生物信息分析的准确性,首先对下机的原始测序数据进行质控,过滤掉低质量片段和宿主片段从而得到高质量的测序数据(c l e a n d a t a),以保证后续分析的顺利㊂原始数据已递交G e n B a n k ,登录号为P R J N A 788346㊂1.5 生物信息学分析按照R o u x 等[15]描述的方法,使用M e ga h i t (h t -t p s ://g i t h ub .c o m /v o u t c n /m e ga h i t )对高质量序列进行拼接㊁组装,挑选ȡ2000b p 的组装序列,使用如下软件进行病毒序列鉴定:V i r F i n d e r (h t t ps ://g i t h u b .c o m /je s s i e r e n /V i r F i n d e r )㊁V i r S o r t e r 2(h t -t p s ://g i t h u b .c o m /s i m r o u x /V i r S o r t e r )㊁C A T (h t -t p s ://gi t h u b .c o m /d u t i l h /C A T ),并对初步鉴定为病毒的序列进行v O T U s (v i r a l o pe r a t i o n a l t a x o -n o m i c u n i t s)分析㊂鉴定得到病毒序列后,获得其物种分类学信息,并使用V P F -C l a s s 工具对病毒进行物种注释和宿主预测㊂挑选置信度(C o n f i d e n c e _S c o r e )>0.36的结果,进行病毒科水平物种注释;挑选置信度(C o n f i d e n c e _S c o r e )>0.5且成员比对率(M e m b e r s h i p_R a t i o )超过0.3的结果,进行病毒(噬菌体)潜在宿主预测[16]㊂1.6 数据分析利用M i c r o s o f t E x c e l (M i c r o s o f t I n c .,W a s h -i n gt o n ,U S A )对数据进行初步统计,随后用S P S S 19.0(S P S S I n c .,C h i c a go ,U S A )对不同流程提取的基因组D N A 质量相关指标进行单因素方差分析(A N O V A )[17]㊂对宏基因组数据进行正态检验和方差齐性检验,符合方差分析的数据用S P S S 进行5392畜牧兽医学报54卷A N O V A分析,不符合方差分析的数据用S P S S软件进行非参数分析,P<0.01表示差异极显著, 0.01ɤP<0.05表示差异显著,0.05ɤP<0.10表示存在趋势㊂瘤胃液病毒相对丰度图㊁箱线图分别利用凌恩生物在线云平台(h t t p://c l o u d.b i o m i c r o-c l a s s.c o m/C l o u d P l a t f o r m)和联川生物在线云平台(h t t p s://w w w.o m i c s t u d i o.c n/t o o l)的工具在线绘制㊂2结果2.1不同提取流程对瘤胃病毒核酸提取质量的影响各流程提取的基因组D N A质检结果见图2㊂由图2a可知,P2流程中D N A产量显著高于P1㊁P3和P4处理流程(P<0.001)㊂P1㊁P2与P3流程获得的D N A的O D260n m/280n m均>1.90,说明提取的核酸相对纯净(图2b)㊂经氯仿处理(P4)的基因组核酸D N A,因产量过低(图2a)而不满足高通量测序需求,故没有进行后续上机建库及组学分析㊂a.核酸浓度;b.核酸纯度㊂*表示P<0.05,**表示P<0.01a.C o n c e n t r a t i o n o f n u c l e i c a c i d s;b.Q u a l i t y o f n u c l e i c a c i d s.*P<0.05a n d**P<0.01图2四种流程处理后所提取的山羊瘤胃液病毒组分的核酸质量(n=3)F i g.2Q u a l i t y o f n u c l e i c a c i d s o f r u m i n a l v i r a l-l i k e p a r t i c l e s e x t r a c t e d f r o m t h e g o a t r u m e n f l u i d i n f o u r g r o u p s(n=3)2.2不同提取流程对瘤胃病毒群落α多样性的影响使用I l l u m i n a N o v a s e q6000平台对符合测序要求的9个样本进行了病毒宏基因组学测序,共获得1058773724个r e a d s,每个样品的平均r e a d s数为117641525,范围为105495627至125358829㊂不同提取流程的瘤胃病毒α多样性指数见图3,不同提取流程对测序时获得的g o o d s_c o v e r a g e比例没有显著影响(图3a),同时不同流程间C h a o1指数(P=0.834)和S h a n n o n指数(P=0.255)均无显著差异㊂a.g o o d s_c o v e r a g e;b.C h a o1指数,用于估计群落中v O T U丰度;c.S h a n n o n指数,用来描述群落中病毒多样性a.g o o d s_c o v e r a g e;b.C h a o1i n d e x,r e p r e s e n t s t h e r i c h n e s s o f v O T U;c.S h a n n o n i n d e x,r e p r e s e n t s t h e d i v e r s i t y o f v i r u s 图3不同处理流程获得的瘤胃液病毒的α多样性指数F i g.3A l p h a d i v e r s i t y i n d e x e s o f r u m i n a l v i r o m e o b t a i n e d f r o m d i f f e r e n t p r o c e s s i n g p r o c e d u r e63927期吴祎程等:宏基因组学技术分析山羊瘤胃病毒的多样性2.3不同提取流程对瘤胃病毒群落β多样性的影响为评估不同样品处理流程对瘤胃病毒群落组成的影响,进行了基于B r a y-C u r t i s距离的P C o A分析及A N O S I M分析㊂在P C o A图中,P2流程与P1和P3在P C o A2上分开(26.01),但差异不显著(A N O S I M R=0.695,P>0.05;图4)㊂结果表明,虽然不同D N A提取流程会导致病毒群落组成的差异,但对群落组成的影响较小㊂2.4不同提取流程对瘤胃病毒群落分类学特征的影响宏基因组测序结果表明,不论采用何种瘤胃液样品病毒组分富集流程,均显示山羊瘤胃中的D N A 病毒主要为噬菌体(图5)㊂其中,绝大多数噬菌体序列来自长尾病毒科(S i p h o v i r i d a e,63.29%)㊁肌尾病毒科(M y o v i r i d a e,11.87%)和短尾病毒科(P o d o v i r i d a e,5.64%),这3个病毒科同属于有尾病图4不同处理流程对瘤胃病毒组分的主坐标分析(基于B r a y-C u r t i s距离,n=3)F i g.4P r i n c i p a l c o-o r d i n a t e s a n a l y s i s b a s e d o n B r a y-C u r t i sd i s t a n ce s of r u m i n a l v i r o m e o b t a i n e d f r o m d i f f e r e n tp r o c e s s i n g p r o c e d u r e(n=3)毒目(C a u d o v i r a l e s)㊂进一步分析了不同富集流程对瘤胃病毒相对丰度的影响,结果表明P E G处理对S i p h o v i r i d a e(P<0.05)及A c k e r m a n n v i r i d a e科(P<0.01)的病毒有显著富集效果(图6)㊂a.总体瘤胃微生物组成;b.总体病毒组分组成;c.不同处理流程瘤胃液中病毒相对丰度(科水平)a.O v e r a l l c o m p o s i t i o n o f r u m e n m i c r o b i a l;b.O v e r a l l c o m p o s i t i o n v i r u s-p a r t i c l e s;c.R e l a t i v e a b u n d a n c e o f v i r u s e s i n d i f-f e r e n t p r o c e s s i n g p r o c e d u r e s(f a m i l y l e v e l)图5黑山羊瘤胃液中微生物组成F i g.5C o m p o s i t i o n o f r u m e n m i c r o b i a l o f b l a c k g o a t*表示P<0.05,**表示P<0.01*m e a n s P<0.05a n d**m e a n s P<0.01图6在不同流程中病毒相对丰度(n=3)F i g.6R e l a t i v e a b u n d a n c e o f v i r a l f a m i l y i n d i f f e r e n t p r o c e s s i n g p r o c e d u r e s(n=3)7392畜牧兽医学报54卷2.5瘤胃病毒群落宿主预测利用V P F-C l a s s工具对山羊瘤胃中最丰富的4个D N A病毒科噬菌体成员进行了宿主预测,并列出了噬菌体与宿主间的对应关系(图6)㊂结果显示瘤胃病毒的宿主多为细菌,优势宿主预测排序结果为:节杆菌属(A r t h r o b a c t e r)㊁芽孢杆菌属(B a c i l-l u s)㊁噬纤维素属(C e l l u l o p h a g a)㊁梭菌属(C l o s-t r i d i u m)㊁乳酸球菌属(L a c t o c o c c u s)㊁分岐杆菌属(M y c o b a c t e r i u m)㊁绿脓杆菌属(P s e u d o m o n a s)㊁里氏杆菌属(R i e m e r e l l a)㊁链球菌属(S t r e p t o c o c c u s)㊂其中,M y o v i r i d a e科的噬菌体主要侵染芽孢杆菌属(B a c i l l u s)细菌,P o d o v i r i d a e科的噬菌体主要侵染噬纤维素属(C e l l u l o p h a g a)的细菌,而S i p h o v i r i d a e 科的噬菌体主要侵染芽孢杆菌属(B a c i l l u s)㊁梭菌属(C l o s t r i d i u m)㊁里氏杆菌属(R i e m e r e l l a)和噬纤维素属(C e l l u l o p h a g a)等属的细菌㊂图7山羊瘤胃病毒群落的潜在宿主种类预测F i g.7P r e d i c t i o n o f p o t e n t i a l h o s t s o f r u m i n a l v i r u s e s i n r u m e n f l u i d o f g o a t s2.6不同生境病毒群落比较本研究将山羊瘤胃病毒群落与其他环境,如人类粪便[4]㊁海洋[5]或土壤[6]病毒群落进行比较(图8)㊂结果表明,不同生境中病毒群落构成存在很大差异:在生境病毒群落多样性方面,以土壤生境最高;在病毒群落相对丰度方面,人类粪便和山羊瘤胃病毒群落的相似性更高,均为以S i p h o v i r i d a e科的病毒为主,但二者又有区别,体现在山羊瘤胃病毒群落具有更高丰度的M y o v i r i d a e科病毒;在病毒核酸类型方面,人类粪便和山羊瘤胃中的D N A 病毒以双链D N A(d o u b l e-s t r a i n D N A,d s D N A)病毒为主,而土壤生境中还含有微病毒科(M i c r o v i r i-d a e)㊁球状病毒科(G l o b u l o v i r i d a e)㊁矮化病毒科(N a n o v i r i d a e)等单链D N A(s i n g l e-s t r a i n D N A,s s-D N A)病毒㊂3讨论瘤胃微生物组成十分复杂,绝大多数瘤胃细菌是严格厌氧或兼性厌氧,且目前仅有很少的瘤胃细菌被分离培养,这导致基于传统培养手段的瘤胃病毒(主要是噬菌体)研究开展起来困难重重㊂近年来宏基因组学广泛运用于动物胃肠道微生态的研究,可规避体外培养微生物的限制㊂该技术也逐步应用于病毒组的研究,借助各种生物信息学分析工具,极大地推进了病毒特异性序列数据集(病毒组)的获取和分析[18]㊂高通量测序过程中,样品D N A的质量尤为关键,提高瘤胃病毒组分基因组D N A的产量及质量,可以有效地提高后续生物信息学分析的准确性㊂在核酸提取和上机测序之前,病毒组分预处理的主要作用为病毒富集和病毒纯化[11]㊂具体步83927期吴祎程等:宏基因组学技术分析山羊瘤胃病毒的多样性图8 山羊瘤胃液㊁人类粪便[4]㊁海水[5]及土壤[6]中的病毒相对丰度F i g.8 R e l a t i v e a b u n d a n c e o f v i r a l c o m m u n i t i e s i n g o a t r u m e n f l u i d ,h u m a n f a e c e s [4],s e a w a t e r [5]a n d s o i l [6]骤需要根据所研究的样本类型进行调整㊂本研究参考C a s t r o -M e jía 等[13]提出的方法,设置了4种流程来评估过滤步骤㊁P E G 沉淀以及氯仿处理对D N A 提取质量以及宏基因组测序结果的影响㊂O D 260n m /280n m 是衡量DN A 提取质量的重要指标,会受R N A 污染以及D N A 降解的影响[19]㊂P 3流程所获得的核酸产量并不是最高的,但P 3流程O D 260n m /280n m在数值上最高,P 4流程所获得的核酸产量最低㊂病毒学研究过程中常使用传统的苯酚-氯仿提取法对病毒基因组进行提取[20],而如今市场上已经出现了多款用于从环境样品中提取病毒基因组D N A 的试剂盒[9,21]㊂本研究选用了价格为Q i a ge n 试剂盒1/5的O m e g a 病毒D N A 提取试剂盒,该试剂盒原用于提取血清病毒基因组,本研究表明,该试剂盒也能用于提取瘤胃液样品中的病毒基因组,且满足测序需求㊂不同流程间瘤胃病毒多样性并没有显著差异,这可能是由于病毒组在整体微生物组中所占比例过小,正如H e s s 等[22]报道的,即使在大多数环境中噬菌体的数量级为细菌的10倍,但由于宿主D N A (细菌和真核生物)的污染,病毒r e a d s 只占可注释D N A 的2%~5%㊂病毒群落结构分析表明,本试验选用的山羊瘤胃中的优势病毒群落依次为长尾病毒科(S i ph o v i r i -d a e )㊁肌尾病毒科(M yo v i r i d a e )和短尾病毒科(P o d o v i r i d a e ),这与前人发表的瘤胃病毒群落以长尾病毒科㊁肌尾病毒科和短尾病毒科占主导地位一致[9]㊂过滤步骤需考虑滤膜孔径大小,常用微孔滤膜孔径为0.22或0.45μm ㊂先前研究表明胃肠道中最丰富的长尾病毒科(S i ph o v i r i d a e )及肌尾病毒科(M yo v i r i d a e )都大于0.22μm [9],故本研究选用了孔径为0.45μm 的微孔滤膜㊂本研究中丰度最高的为长尾病毒科(S i ph o v i r i d a e ),也证明了0.45μm 滤膜的有效性㊂由于病毒颗粒小,在核酸提取之前,通常使用P E G 配合N a C l 来沉淀样品中的V L P s 以实现病毒的浓缩㊂本研究表明,P E G 可显著富集有尾病毒目中的长尾病毒科(S i ph o v i r i -d a e )及A c k e r m a n n v i r i d a e 科噬菌体㊂本研究还发现疱疹病毒科(H e r p e s v i r i d a e )的病毒在该瘤胃液样本中的存在,但丰度十分低㊂C s C l 密度梯度离心步骤被认为是纯化病毒的最佳方法[12],此法可对特定密度范围内的噬菌体进行纯化,并根据密度将V L P s 与其他组分分离㊂但这一技术耗时㊁昂贵且需要特定的技术技能和实验室设备㊂有研究发现,氯仿处理能代替氯化铯密度梯度离心步骤用于纯化病毒[23],此方法已成功用于9392畜牧兽医学报54卷血清病毒纯化和发酵食品病毒纯化[24-25]㊂但本研究发现,氯仿处理在瘤胃液病毒纯化中会造成大量颗粒损失,以至于不能满足高通量测序的需求㊂这是因为瘤胃细菌仍为瘤胃液的主要部分,氯仿会严重干扰包膜类物质,比如细菌,而且有些病毒也存在膜结构,膜结构被破坏后,病毒的蛋白质外壳会变得不稳定[26]㊂而部分病毒蛋白质外壳也对氯仿十分敏感,氯仿处理则造成这类病毒的大量丢失[27]㊂D N A产量也因此出现显著差异,P4提取流程的核酸因产量过低,不适用于高通量测序建库㊂因此,氯仿处理代替C s C l密度梯度离心步骤用于纯化瘤胃病毒还有待后续试验进一步研究㊂环境中病毒的多样性和丰度与微生物群落息息相关㊂有研究表明同一环境中病毒群落具有很高的相似性,而来自不同环境的病毒及其宿主分布的相似性较低[28-30]㊂反刍动物会从外界摄入大量食物,瘤胃作为一个天然发酵罐,微生物群落共生于一个相对封闭的容器中,这导致瘤胃微生物具有非常独特的群落特征[1],瘤胃液中病毒的丰富度反映了瘤胃微生物宿主的多样性㊂由于病毒宏基因组学建库限制以及测序平台对核酸样品扩增的需求,本研究主只检测了山羊瘤胃液中的D N A病毒,发现样品中主要为d s D N A病毒,它们都属于有尾病毒目㊂之前的大量研究也表明瘤胃病毒以d s D N A为主,其中大部分为有尾病毒目的噬菌体[9,21,31-32]㊂另外,由于技术的局限性,本方法提取的D N A不一定满足长读长测序平台,例如P a c B i o(w w w.p a c b.c o m) o r O x f o r d N a n o p o r e(h t t p s://n a n o p o r e t e c h.c o m)㊂此外,本试验只关注了病毒组分中d s D N A的核酸,此病毒组分富集方法是否适用于s s D N A或R N A 病毒尚不清楚[33]㊂4结论本研究比较了不同D N A提取流程对核酸产量㊁质量㊁病毒多样性以及病毒概况的影响,表明了P E G沉淀步骤对长尾病毒科及A c k e r m a n n v i r i d a e 科噬菌体具有富集作用㊂研究人员可根据试验需求进行选择,当需要重点关注这类噬菌体的情况下,可采用P3流程,即对瘤胃液进行离心㊁稀释以及微孔滤膜过滤操作,若对特定病毒没有富集需求,则采用P2流程即可,即无需进行微孔滤膜过滤步骤,此两种流程均能达到病毒宏基因组测序要求㊂基于以上结果,本试验构建了提取瘤胃液中病毒组分D N A 的流程,此方案可大大促进反刍动物瘤胃液中噬菌体群落的研究进程㊂参考文献(R e f e r e n c e s):[1] D E N G W D,X I D M,MA O H M,e t a l.T h e u s e o fm o l e c u l a r t e c h n i q u e s b a s e d o n r i b o s o m a l R N A a n dD N A f o r r u m e n m i c r o b i a l e c o s y s t e m s t u d i e s:Ar e v i e w[J].M o l B i o l R e p,2008,35(2):265-274. 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病毒宏基因组学在医学领域的应用_范胜涛
近年来，新发、突发传染病不断出现，由于其不可预知性和突发性，同时具有病死率高、危害性大等特点，因而引起社会恐慌。
然而，现有的常规检测只能针对我们已知的病原微生物，对于未知病原体仍然缺乏相应的鉴别手段。
传统的诊断技术已不能满足或很难适应提前预警或快速诊断新发传染性疾病的需求。
挖掘潜在的新病毒或未知病原体将是人类预防、诊断和治疗新发传染病的最有效的途径。
现有的病毒检测技术受多方面的限制。
病毒宏基因组学（viral mretagenomics ）是在宏基因组学（metagenomics ）理论的基础上，结合现有的病毒分子生物学检测技术而兴起的一个新的学科的分支，近年来，其在医学及公共卫生领域显示了巨大的优越性。
本文主要对近10年来病毒宏基因组的兴起、优势及策略、在临床检测及公共卫生领域的应用进展作一综述。
1病毒宏基因组的兴起宏基因组学是由Schmidt 等［1］和Handelsman等［2］于20世纪90年代提出的一门应用学科，迄今为止，其研究对象已从最初的土壤微生物发展到水体浮游微生物、海水及海底沉积物、空气悬浮物以及动植物体附生微生物等。
目前99%以上微生物在现有实验室条件下都无法进行培养，所以利用宏基因组技术来研究那些大量未知的微生物序列信息，可以跨越微生物研究的初始瓶颈，在很大程度上改变人们对微生物世界的传统认识。
而病毒宏基因组学是以微生物中的病毒为研究对象，近年来随着高通量测序技术的不断发展，尤其是新二代测序仪的出现，使病毒宏基因组学发展尤为迅速。
从2002年至今，许多研究成果及重大成就的取得都离不开该技术的运用，见图1。
近年来，该技术的应用的范围也不断扩大，涵盖了农业、林业、环保、医药、公共卫生安全等多个领基金项目：863计划（2012AA022006）.通讯作者：夏咸柱，E -mail ：xiaxzh@病毒宏基因组学在医学领域的应用范胜涛1，2，高玉伟2，夏咸柱1，21.中国医学科学院北京协和医学院医学实验动物研究所，北京100021；2.军事医学科学院军事兽医研究所，吉林长春130122摘要：新发、再发病毒性传染病不断出现，如何快速鉴别致病病原显得尤其重要。
浅谈宏基因组学的应用
浅谈宏基因组学的应用宏基因组学由Handelsman和Rodon于1998年首次提出，并成为研究复杂的肠道微生物群落的另一种DNA测序方法。
它旨在对样本中提取的所有DNA进行随机测序，并对一个群落的所有基因进行分析，即环境中所有微生物基因组的总和。
以粪便样本的宏基因组学为例，首先从粪便样本中提取所有微生物的总DNA。
在测序之前，总DNA样本通过“鸟枪法（shotgun）”对总DNA样本进行随机剪切。
之后，对综合序列进行分析，以获得基于系统发育标记（16S rDNA）的物种图谱或基于全基因组的基因组图谱[1]。
宏基因组的分析流程主要包括环境样本收集、宏基因组DNA提取、文库准备、测序、DNA序列分析。
宏基因组测序的应用不胜枚举，本篇文章就一些方面介绍宏基因组的应用。
01宏基因组在微生物监测方面的应用1.1公共卫生的传统病原体监测现有的公共卫生病原体监测方法包括对特定病原体的主动筛查，如CRE、MRSA以及VRE等，或是基于感染事件或医院特定病房相关病原体的监测。
当环境污染物在流行病学上与疫情调查有关时，对空气、水和表面进行有针对性的采样，以确定潜在的来源。
来自疫情调查的培养分离株通常接受各种分型，如多点序列分型（MLST），以确定疾病传播途径。
因此，需要各种各样的实验室技术、设备、试剂和相关专业技能人员在医院对已知的人类病原体子集进行监测。
社区病原体监测主要在医院、净水厂和农场进行，并有多种方法，表1列举了一些传统的监测方法。
ELISA, enzyme-linked immunosorbant assay, 酶联免疫吸附实验; MAST, multi-antigen sequence typing, 多抗原序列分型; MLVA, multiple locus variable-number tandem repeat analysis, 多基因座可变数目串联重复序列分析; NAATs, nucleic acid amplification tests, 核酸扩增实验; PFGE, pulse-field gel electrophoresis, 脉冲场凝胶电泳; RT–PCR, Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction，逆转录聚合酶链反应; WGS, Whole Genome Sequence, 全基因组测序。
54. 病毒宏基因组学
病毒宏基因组学（Meta-virome）病毒宏基因组学（Meta-virome）是在宏基因组学理论的基础上，结合现有的病毒分子生物学检测技术而兴起的一个新的学科分支，是某类样本中所有病毒(virus)或病毒类似物(virus-like-particle)及其所携带遗传信息的总称。
宏病毒组直接以环境中所有病毒的遗传物质为研究对象，能够快速准确的鉴定出环境中所有的病毒组成，在病毒发现、病毒溯源、微生物预警等研究方面具有重要作用。
宏病毒研究可应用于人或动物肠道或者血液样本、海洋、土壤等的研究，用以挖掘潜在的对人类和环境的危害。
易基因科技同丹麦哥本哈根大学知名微生物课题组联合开发高效的宏病毒组颗粒富集方法，可对微量样本进行病毒颗粒富集，并保证病毒活性及高均质性，为宏病毒组学、噬菌体与细菌之间的互作关系等研究提供优良技术支持，保驾护航!技术路线信息分析由NT-V、ViPR、PATRIC、IRD等数据库序列组成的非冗余病毒序列数据库。
技术参数样本要求∙样本直接运输（干冰）；粪便、土壤、底泥建议≥400mg（最低不低于200mg）；水样需微孔滤膜过滤后送样。
∙测序策略：PE150∙其他注意事项：①最终样本质量以我司的检测结果为准；②若样本总量超过要求，可以进行样本保存，反样；项目完成后，将不再保存剩余样品。
项目周期∙15个样本以下标准运转周期约为45个工作日，大样本量项目需分批建库，项目周期需要与技术支持人员确定。
产品优势∙可对微量样本中的病毒组进行有效分离。
∙对噬菌体不造成损伤，最大程度保证了病毒活性，适用于下游FVT研究。
∙相较于传统的PEG，CsCl等方法，均质性高，噬菌体偏好性低。
∙全面的数据分析策略，定制的多组学关联数据挖掘。
研究案例噬菌体是粪便病毒组的主要成员，粪便病毒组移植（FVT）或能有效的调节肠道菌群。
Gut 最新发表了来自丹麦哥本哈根大学团队（易基因合作方）的研究，在该项概念验证试验中发现，接受瘦小鼠的粪便病毒组移植后，饲喂高脂食物的小鼠体重增长变慢，同时还能保持正常的血糖指标，FVT引起的肠道菌群变化介导了这些保护性功能代谢作用。
病原宏基因组
病原宏基因组
1 宏基因组研究
宏基因组研究是指研究基因组结构及其功能，及其在生物和环境
中的行为,从而明确有关病原体的进化和发病机制，以及可提供相应策略。
宏基因组技术可通过分析大量的基因测序序列来解释基因组信息，发现蛋白质、代谢物和活性因子的修饰情况。
2 宏基因组的应用
在病原学研究中，宏基因组研究可以帮助研究人员了解病原体的
分布特征和传播方式，以及病原菌感染宿主机时所引起的疾病机理。
通过宏基因组研究，可以深入研究病原体的基因结构及其功能，从而
更好地开发临床病原定性和定量诊断方法，以及对宿主进行抗感染治
疗的指导方针。
3 病原宏基因组研究
病原宏基因组研究是一种特殊的宏基因组分析技术，旨在深入细
化病原体的基因组并揭示其全貌。
病原宏基因组研究可用于研究病原
体的进化、发生机制和传播路径。
此外，病原宏基因组研究技术还可
以对病原体的生物化学特性、稳定性和耐药性等方面进行细致的分析，以提供有效的抗感染治疗或疫苗研制方案。
4 社会意义
宏基因组研究，特别是病原宏基因组研究为全球疾病预防与控制
发挥着重要作用，其研究结果可以帮助我们了解病原体的繁殖和传播
机制，更好的预防疾病的发生，并有助于发展更有效的抗感染治疗策略。
研究结果还可以帮助我们开发针对特定病原体的诊断与治疗方案，以及��展更精准的疫苗，从而控制疾病在全球的传播。
宏基因组学：探索海洋病毒世界的新工具
宏基因组学：探索海洋病毒世界的新工具作者：汪俭来源：《科教导刊·电子版》2015年第08期摘要海洋病毒，主要是感染微生物的噬菌体，是海洋世界中最丰富的生物体。
由于大于99%的微生物宿主不能被培养，并且病毒基因组没有一个通用的标记基因，利用传统的培养和PCR的方法不能够完全了解环境中病毒群落的多样性和动态学性质。
病毒宏基因组学（metagenomics）研究突破了这些方法的限制，直接以环境样品中病毒群体的基因组为研究对象，探究环境中病毒群落结构和功能，极大地丰富了对海洋病毒多样性及其功能的认识。
关键词海洋病毒宏基因组学多样性病毒是海洋生态系统中数量最庞大的生物体，在生物地球化学循环中起着重要作用，可以影响微食物环中的C、N流，调节水体中的微生物群落结构，维持微生物的多样性，介导微生物之间的基因转移。
传统的研究病毒的方法是通过培养分离的方法，得到纯种的病毒，但是这种方法由于大部分的病毒不可培养，导致对自然环境中整个病毒群落的了解知之甚少。
另外，由于病毒没有像原核生物和真核生物16sRNA、18sRNA一样的标记基因去鉴别它的多样性，而病毒宏基因组学（metagenomics）研究突破了这些限制，直接以生境中整个病毒群落的基因组为研究对象，探究环境中病毒群落结构和功能，极大地丰富了对海洋病毒多样性及其功能的认识。
病毒宏基因组学可以研究各种环境下的病毒群落，阐明环境病毒的遗传潜力、群落结构和生物地理学，提高我们对病毒生态学的认识。
其次，病毒群落尤其是噬菌体群落的宏基因组学分析，为我们研究微生物生态和环境动力学提供了一个有效的工具。
病毒编码的功能基因代表着环境中最重要的代谢过程，并且病毒代谢过程在不同的环境中也是不同的。
在海洋环境中，噬菌体和藻类病毒都携带有光合基因，能够使它们的宿主在强光下进行光合作用。
还有许多噬菌体编码抗生素基因、宿主免疫抗性基因和毒力因子例如毒素，能增加其宿主的致病性。
病毒宏基因组学研究还能够向我们提供相关环境信息，因为丰富的病毒很可能代表着丰富的宿主群落，并且病毒多样性与环境的复杂性息息相关。
细菌宏基因组与病毒宏基因组测序的样本处理方法及应用
01 引言
03 实验流程
目录
02 样本处理方法 04 数据分析
05 应用场景
07 参考内容
目录
06 断等领域，细菌宏基因组与病毒宏基因 组测序技术正发挥着越来越重要的作用。这两种测序技术能够揭示微生物群落的 完整基因组信息，有助于深入了解微生物生态系统的多样性、物种间的相互关系 以及与环境因素的相互作用。本次演示将详细介绍细菌宏基因组与病毒宏基因组 测序的样本处理方法及应用。
3、体积及注意事项
对于细菌宏基因组测序，每个样品所需体积通常为1-2克，应注意样品的代 表性。对于病毒宏基因组测序，由于病毒粒子通常较少，因此每个样品所需体积 通常为几十至上百微升。在此过程中，应注意避免样品污染和交叉感染。
实验流程
1、DNA提取
对于细菌宏基因组测序，可采用试剂盒或自提取方法提取细菌DNA。对于病 毒宏基因组测序，由于病毒DNA往往与蛋白质紧密结合，需采用特定的裂解液和 蛋白酶K上机进行测序反应。
5、数据处理和分析：对获得的原始测序数据进行处理和分析，包括质量控 制、序列组装和基因组注释等。
实验结果
通过宏基因组二代测序技术，我们成功地检测出了待测病毒的基因组序列， 并确定了其种类、亚型和变异情况。此外，我们还发现了一些新的病毒基因组特 征和与宿主之间的相互作用机制。这些结果为抗病毒药物和疫苗的研究提供了有 价值的科学依据。
结论
综上所述，宏基因组二代测序技术在病毒病原检测中具有广泛的应用前景和 潜力。虽然该技术存在一定的局限性，但随着技术的不断发展和完善，相信宏基 因组二代测序技术将在未来的病毒病原检测中发挥更大的作用。对于未来的研究， 我们建议进一步探索如何提高该技术的灵敏度和特异性，以更好地满足实际应用 的需求。
病毒宏基因组学检测猪博卡病毒及其遗传进化分析
病毒宏基因组学检测猪博卡病毒及其遗传进化分析孙晓瑜;单虎;黄娟【期刊名称】《中国兽医杂志》【年(卷),期】2024(60)4【摘要】为了探明导致某养猪场中仔猪腹泻的病原,本试验将患病仔猪样本处理并提取核酸后进行病毒宏基因组测序,对测序结果进行序列比对分析和遗传进化分析,并对样本核酸进行PCR检测验证。
结果显示,RNA样本中只注释到A型流感病毒(H1N1和H3N2),读数比为6.8%,未发现其他猪病相关RNA病毒。
DNA样本注释到的病毒主要为猪博卡病毒(PBoV),读数比为34.5%,命名为PBoV-SDPD-2022;其余猪病相关病毒包括猪巨细胞病毒、猪乳腺腺病毒和猪细环病毒,读数比均小于1.0%。
基于全基因组、NS 1基因和VP 1基因构建的系统发育进化树均显示,PBoV-SDPD-2022与参考毒株PBoV3_VIRES_HuB01_C1处于同一分支,属于PBoV G3群。
与21株参考毒株相比,PBoV-SDPD-2022 NS1蛋白的编码基因核苷酸和氨基酸序列同源性分别为49.6%~97.2%和38.5%~95.3%;VP1蛋白的编码基因核苷酸和氨基酸序列同源性分别为47.9%~97.9%和34.8%~98.8%;NP1蛋白的编码基因核苷酸和氨基酸序列同源性分别为35.2%~98.5%和26.9%~97.4%。
与G3群参考毒株相比,PBoV-SDPD-2022 NS1蛋白在第654位点处有1个氨基酸的缺失;VP1蛋白在第151、152位点处有2个氨基酸的插入,且包含基序YLGPF(VPl aa 18~22)和HDLAY(VP1 aa 41~45);NP1蛋白在第15、16、35、36、212位点处发生氨基酸的缺失,在第95位点处有1个氨基酸的插入。
PCR检测证实样本核酸为PBoV阳性。
结果表明,导致该养猪场仔猪腹泻的优势病原是G3群PBoV。
本试验有助于进一步了解我国PBoV基因组序列特征,并为未来PBoV 流行病学调查提供了参考依据。
病毒宏基因组学
宏基因组学 研究的对象是特 定环境下所有生 物遗传物质的总 和，它包含了可 培养的和不可培 养的微生物的基 因总和。研究热 点：细菌和病毒 宏基因组学。
病毒宏基因组学
病毒宏基因组学：宏基因组学的一分支，指研究特定环境中的病 毒群落一门学科。
分析特定环 境中的病毒
群落
应用
解释未 知病因
2020/7/17
应用病毒宏基因组学技术结合高通量测序和生物信息学分析我国腹泻仔猪粪便内的病毒群 落，初步鉴定出此次腹泻的主要病因为变异PEDV；分离和鉴定1 株变异PEDV（JS2013），其可作为研发疫苗的候选毒株（单同领，童光志，2013）。
2020/7/17
前景展望
前景展望
运用病毒宏基因组学，已经成功地从多种环境样品 中鉴定出多种病毒，使人们了解到不同环境的病毒构成 ，从而更科学地防制病毒的侵染。
高通量测序
罗氏公司454焦磷酸测序技 术和Illumina公司推出的 Solexa测序技术
受限于表达 型的宿主菌 株、工作量 大及效率低。
荧光原 位杂交 技术法
序列拼接--拼接的contigs或者单序 列通过不同的数据库进行核苷酸和 氨基酸的比对--筛选有用的目的信息。
研究成果与前景展望
对患有肠道病毒性肠炎的火鸡群，进行病毒宏基因组学分析，发现了大量的呼肠孤病毒、 小ＲＮＡ病毒、星状病毒等，系统描述了多种病毒共同感染火鸡，导致火鸡生产性能降低 的可能性（Day，2010）。 对采集北美的蝙蝠粪便进行病毒组学研究，结果发现蝙蝠体内携带的病毒种类十分丰富， 不仅含有大量的动物病毒，而且还有植物和昆虫病毒（Li，Donaldson，2010）。 在美国猪群中发现了kubovirus,sapovirus,sapelvirus,猪肠道病毒9和猪肠道病毒10，星 状病毒，Teschovirus，PBoV3,环病毒，新的微小核酸RNA病毒等。其中星状病毒和 PBoV3为新的种；环病毒、Rosavirus1 和Rosavirus1 可能为的新的病毒属或者新的病毒 科（单同领，2011）。 在我国腹泻儿童粪便中首次发现HBoV2、HPeV、Aichi virus、Klassevirus/salivirus和 Human cosavirus 等新发病毒（单同领，2011）。
宏基因组诊断标准
宏基因组诊断标准主要基于以下两个方面：
临床需求：宏基因组测序（mNGS）可用于诊断、监测和跟踪新的疾病暴发，挽救生命并降低控制成本。
技术特性：宏基因组学是下一代测序的一个领域，可以识别微生物群落，以及基因检测、识别和表征致病因子。
它已被证明是病毒遗传特征的关键因素，并导致了使用传统培养技术无法完成的发现。
质量控制（QC）组装对组装后序列进行物种注释（识别已经测序的已知病毒和识别尚未测序或未知的病毒）。
如需了解更多信息，建议查阅有关宏基因组诊断的最新论文、研究报告或行业资讯。
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病毒宏基因组学何以横空出世
很多病毒缺乏特异的 细胞系或者生长过程 中观察不到细胞病变
用电镜来观察病毒 其灵敏性相对较低。
(CPE)。
四大
瓶颈 PCR法必须基于基因
血清学反应，高效的特异
序列，对于未知序列的病
性抗体很难获得，有的出
毒和变异性大的病毒此法
现交叉反应而影响结果。
难以实施。
宏基因组学
宏基宏因基组因学组(学M(eMtaegtaegneonmoimcsi)c是s) 将环是境将中环全境部中微全生部物微的生遗物传的信遗传 息看信作息一看个作整一体个,整自体上, 而自下上地而研下 究微地生研物究与微自生然物环与境自或然生环物境体或生 之间物的体关之系间。的关系。
研究策略与技术路线
样品的处理 遗传物质的分离与富集 构建 宏基因组学的筛选序列分析
2020/5/12
研究策略与技术路线
VIS:Very Important Step
稀释
解冻
样品的处理
消化
过滤
离心
2020/5/12
研究策略与技术路线
反转录 双链 cDNA 合
成
DNA RNA
PCR 关系
2020/5/12
基因组学的载体和方法也各有不同。构建的宏基
文 因组学分为载体克隆和基于新一代测序技术的 库 加接头的建 体(bacterial artificial chromosome,BAC）和粘粒
连接
转化
筛选阳 性克隆
研究策略与技术路线
连接
目的基因
载体
载体的种类 质粒（plasmid） λ噬菌体（λ phage） 粘粒载体（cosmid） 细菌人工染色体BAC 酵母人工染色体YAC
可装载的外源DNA ＜10kb
0-23kb ~45kb
~100kb ~300kb-1.2Mb
读书报告
汇报人：李小阳
2020/5/12
2103年1月4日
病毒宏基因组学概述及其应用
研究背景 宏基因组学简介 病毒宏基因组学 研究策略与技术路线 研究成果与前景展望
Here We Go！
一大难题
virus B
virus C
virus A virus D
BACTERIA
在人类生产生活中，致病的微生物众多，其中病毒性疾病占据大多
发掘潜在 的新的病 毒性疾病
挖掘新 的活性 物质
病毒宏基因组学
最早应用宏基因组学理论分析病毒群落的科学家是Breitbart教 授，他于2002年应用鸟枪测序法（shotgun sequencing）首次对 美国加州海岸的2处海洋中病毒群体进行研究，发现374-7114个潜 在的新病毒。
2005年,Edwards首次提到病毒宏基因组学这一概念，其描述的 是环境中的病毒群落—噬菌体。
（coamid）载体]、表达载体(pBluescript SK+)、穿梭载
体(Cosmid pOS700Ⅰ)及普通克隆T载体。
2020/5/12
研② 高纯度大分子量基因组 DNA的提取。 ③ 高质量大相对分子质量 DNA 的部分酶切与脉冲电 泳分级分离。 ④ 载体与外源片段的连接 与转化或侵染宿主细胞。 ⑤ 重202组0/5/1克2 隆的挑取和保存。
遗传物质的 分离与富集
2020/5组DNA或cDNA片段 与适当的载体在体外通 过重组后，转化至宿主 细胞，并通过一定的选 择机制筛选后得到大量 的阳性菌落(或噬菌体), 所有机械力量切割成 一定长度的DNA片段，与合适载体体 外转化至宿主细胞补DNA。cDNA是 由生物的某一特定器官或特定发育时 期细胞内的mRNA经体外反转录后形 成的双链cDNA 。
宏基因组学 研究的对象是特 定环境下所有生 物遗传物质的总 和，它包含了可 培养的和不可培 养的微生物的基 因总和。研究热 点：细菌和病毒 宏基因组学。
病毒宏基因组学
病毒宏基因组学：宏基因组学的一分支，指研究特定环境中的病 毒群落一门学科。
分析特定环 境中的病毒
群落
应用
解释未 知病因
2020/5/12
案例2：
2013年6月巴西圣 保罗阿道夫•鲁茨 研究所的西尔瓦娜 等人利用病毒宏基 因组学对人面部潜 在微生物进行研究。
Electron micrographs of the human fecal sample. (a) Rod-shaped particles negatively stained with potassium phosphotungstate in 2003. (b) Icosahedral (open arrows)and short rod-shaped particles (filled arrow) recently stain2e02d0/w5/1it2h ammonium molybdate, from the second fraction of the sucrose gradient.
数，而现有的诊断方法不可能囊括所有的病毒。因此，从宏观上把
握致病性病毒的潜在数量种类以及致病机理变得尤为重要。
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两个案例
案例1： 2002年Breitbart应用鸟枪测序法（shotgun sequencing）首次 对美国加州海岸的2处海洋中病毒群体进行研究，发现374-7114 个潜在的新病毒。遗憾的是无法对其进行归类。
2006年，Zhang等应用宏基因组学在人的粪便中发现了大量的 植物病毒。
2007 年, Delwart 再次提到病毒宏基因组学这一概念,并对宏基 因组学挖掘新病毒的方法进行了阐述； 该文侧重于人和动物机体 中的真核病毒群落。
2010 年，Li 等分析了蝙蝠粪便中的病毒群落。该研究发现了大 量新的哺乳动物病毒和昆虫病毒。