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基因定点突变技术
定点突变
定点突变是指通过聚合酶链式反应（PCR）等方法向目的DNA片段 （可以是基因组，也可以是质粒）中引入所需变化（通常是表征 有利方向的变化），包括碱基的添加、删除、点突变等。定点突 变能迅速、高效的提高DNA所表达的目的蛋白的性状及表征，是基 因研究工作中一种非常有用的手段。
定点突变的目的
• 基因定点的突变是指按照设计的要求，使基因的特定序列发生 插入、删除、置换和重排等变异。
• 体外定点突变技术是研究蛋白质结构和功能之间关系的有力工 具。
• 蛋白质的结构决定其功能，对某个已知基因的特定碱基进行定 点改变，缺失或者插入，可以改变对应的氨基酸序列和蛋白质 结构和功能，改造酶的不同活性或者动力学特性。
定点突破的方法
• 寡核苷酸介导的基因突变指用含有突变碱基的寡聚核苷酸
片断作为引物，在聚合酶的作用下启动DNA分子进行复 制。
• 盒式突变是利用一段人工合成的含基因突变序列的寡核
苷酸片段，取代野生型基因中的相应序列。
• PCR介导的基因突变
寡核苷酸介导的定点突变
• 寡聚核苷酸定点诱 变技术是由加拿大 的生物化学家 ( michael smith )发明 的.
• 定点突变技术的潜在应用领域很广，比如研究蛋白质相互 作用位点的结构、改造酶的不同活性或者动力学特性，改 造启动子或者DNA作用元件，引入新的酶切位点，提高蛋白 的抗原性或者是稳定性、活性、研究蛋白的晶体结构，以 及药物研发、基因治疗等等方面。
应用前景
• 不同于定点突变的是基于PCR的随机突变，通过改变PCR条件提高 PCR过程中的随机出错，这种方法适用于未知的蛋白质，作全局 性分析，所以有人称为饱和突变（saturation mutagenesis）。 不过这种方法由于没有目的性，分析操作相当繁琐，并且不会出 现一个位点2个以上碱基突变，因而应用上有局限性。定点突变 适用于蛋白结构已有初步了解的基因，比PCR随机突变更有目的 性，也更为精确，简单，同时改造基因更加“随心所欲”。由于 定点突变技术在蛋白质组学中有这非常广泛的应用前景，相信这 个技术在不远的将来还会有更大的改进和发展，也必将为更多人 熟悉应用。
此课件下载可自行编辑修改，仅供参考！ 感谢您的支持，我们努力做得更好！ 谢谢!
源自文库
在分子生物学和基因工程中的应用
探明未知序列的结构和功能的关系，如启动子诱变筛选，真 核的TATA盒保守序列确定。 载体构建：调控元件，强启动子，多接头。 研究基因调控序列，如AUG前加入ACC序列最佳。
在蛋白质工程中的应用
降低毒性，如TNF 改变亚型和种的特异性，如IFN的23位AAG（赖氨酸），AGG （精氨酸），使IFN2a变成IFN2b。123位Try（酪）变甘/丝， 使IFN种属特异性明显改变，对人抗病毒活性小于牛。 提高活性和稳定性，如IFN- βser17（cys变ser） 提高蛋白质作用的专一性，如IFNβ的9-56位被IFNa的7-54位 取代后，活性提高40倍。
寡核苷酸定点突变基本原理
• 合成一段寡聚脱氧核糖核苷酸作为引物，使其与带有目的基因 完全互补。
• 合成的寡核苷酸引物除短的错配区外，与目的基因完全互补。 • 然后用DNA聚合酶使寡核苷酸引物延伸，完成单链DNA的复制。 • 由此产生的双链DNA，一条链为野生型亲代链，另一条为突变型
子代链。 • 将获得的双联分子通过转导入宿主细胞，并筛选出突变体其中
• 在最初所建立的PCR方法中就可看出只要引物带有错配碱 基便可使PCR产物的末端引入突变。但是诱变部分并不总 在DNA的中间部分进行诱变。
• 目前采用重组PCR进行定位诱变，可以在DNA片段的任意部 位产生定位突变。
重叠延伸的介导的突变
大引物诱导法
定位突变用途
• 定点突变法的应用不仅广泛用于基因工程技术领域，还可 用于农业培育抗虫、抗病的良种，用于医学矫正遗传病、 治疗癌症等病。
基因已被定向修改
盒式突变
• 1985年Wells提出的一种基因修饰技术—盒式突变。
• 盒式突变：用一段人工合成具有突变序列的DNA片段，取代 野生型基因中的相应序列。
• 然而，并非所有变异区附近都能找到合适的限制位点，如 果不存在限制位点，就要用寡核苷酸指导的定位诱变引入 限制位点。
PCR介导的定点突变
定点突变
定点突变是指通过聚合酶链式反应（PCR）等方法向目的DNA片段 （可以是基因组，也可以是质粒）中引入所需变化（通常是表征 有利方向的变化），包括碱基的添加、删除、点突变等。定点突 变能迅速、高效的提高DNA所表达的目的蛋白的性状及表征，是基 因研究工作中一种非常有用的手段。
定点突变的目的
• 基因定点的突变是指按照设计的要求，使基因的特定序列发生 插入、删除、置换和重排等变异。
• 体外定点突变技术是研究蛋白质结构和功能之间关系的有力工 具。
• 蛋白质的结构决定其功能，对某个已知基因的特定碱基进行定 点改变，缺失或者插入，可以改变对应的氨基酸序列和蛋白质 结构和功能，改造酶的不同活性或者动力学特性。
定点突破的方法
• 寡核苷酸介导的基因突变指用含有突变碱基的寡聚核苷酸
片断作为引物，在聚合酶的作用下启动DNA分子进行复 制。
• 盒式突变是利用一段人工合成的含基因突变序列的寡核
苷酸片段，取代野生型基因中的相应序列。
• PCR介导的基因突变
寡核苷酸介导的定点突变
• 寡聚核苷酸定点诱 变技术是由加拿大 的生物化学家 ( michael smith )发明 的.
• 定点突变技术的潜在应用领域很广，比如研究蛋白质相互 作用位点的结构、改造酶的不同活性或者动力学特性，改 造启动子或者DNA作用元件，引入新的酶切位点，提高蛋白 的抗原性或者是稳定性、活性、研究蛋白的晶体结构，以 及药物研发、基因治疗等等方面。
应用前景
• 不同于定点突变的是基于PCR的随机突变，通过改变PCR条件提高 PCR过程中的随机出错，这种方法适用于未知的蛋白质，作全局 性分析，所以有人称为饱和突变（saturation mutagenesis）。 不过这种方法由于没有目的性，分析操作相当繁琐，并且不会出 现一个位点2个以上碱基突变，因而应用上有局限性。定点突变 适用于蛋白结构已有初步了解的基因，比PCR随机突变更有目的 性，也更为精确，简单，同时改造基因更加“随心所欲”。由于 定点突变技术在蛋白质组学中有这非常广泛的应用前景，相信这 个技术在不远的将来还会有更大的改进和发展，也必将为更多人 熟悉应用。
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源自文库
在分子生物学和基因工程中的应用
探明未知序列的结构和功能的关系，如启动子诱变筛选，真 核的TATA盒保守序列确定。 载体构建：调控元件，强启动子，多接头。 研究基因调控序列，如AUG前加入ACC序列最佳。
在蛋白质工程中的应用
降低毒性，如TNF 改变亚型和种的特异性，如IFN的23位AAG（赖氨酸），AGG （精氨酸），使IFN2a变成IFN2b。123位Try（酪）变甘/丝， 使IFN种属特异性明显改变，对人抗病毒活性小于牛。 提高活性和稳定性，如IFN- βser17（cys变ser） 提高蛋白质作用的专一性，如IFNβ的9-56位被IFNa的7-54位 取代后，活性提高40倍。
寡核苷酸定点突变基本原理
• 合成一段寡聚脱氧核糖核苷酸作为引物，使其与带有目的基因 完全互补。
• 合成的寡核苷酸引物除短的错配区外，与目的基因完全互补。 • 然后用DNA聚合酶使寡核苷酸引物延伸，完成单链DNA的复制。 • 由此产生的双链DNA，一条链为野生型亲代链，另一条为突变型
子代链。 • 将获得的双联分子通过转导入宿主细胞，并筛选出突变体其中
• 在最初所建立的PCR方法中就可看出只要引物带有错配碱 基便可使PCR产物的末端引入突变。但是诱变部分并不总 在DNA的中间部分进行诱变。
• 目前采用重组PCR进行定位诱变，可以在DNA片段的任意部 位产生定位突变。
重叠延伸的介导的突变
大引物诱导法
定位突变用途
• 定点突变法的应用不仅广泛用于基因工程技术领域，还可 用于农业培育抗虫、抗病的良种，用于医学矫正遗传病、 治疗癌症等病。
基因已被定向修改
盒式突变
• 1985年Wells提出的一种基因修饰技术—盒式突变。
• 盒式突变：用一段人工合成具有突变序列的DNA片段，取代 野生型基因中的相应序列。
• 然而，并非所有变异区附近都能找到合适的限制位点，如 果不存在限制位点，就要用寡核苷酸指导的定位诱变引入 限制位点。
PCR介导的定点突变