污染源及其表现特征

污染源及其表现特征

150152625戴雨柔摘要：污染是指在组培过程中，由于真菌、细菌等微生物的侵染，在培养容器中滋生大量菌斑，使培养材料不能正常生长和发育的现象。组织培养中污染是经常发生的，造成污染的原因有很多。为了减少损失，提高工作效率，必须在每个操作环节上都注意防止污染的发生。

关键词：侵染原因防止污染

第一点关于污染的病原类型。组织培养中污染是经常发生的。污染的病原主要分为细菌和真菌两大类。细菌污染的特点是菌斑呈黏液状，而且在接种1~3d 即可发现。除材料带菌或培养基灭菌不彻底会造成接种材料被细菌污染外，操作人员的不慎也是造成细菌污染的重要原因。真菌污染的特点是污染部分长有不同颜色的霉菌，在接种3d甚至半个月后才出现。造成真菌污染的原因多为外植体本身带菌、周围环境不清洁、超净工作台过滤装置失效、培养皿口径过大等。

然后让我们来分析导致污染发生原因。可分为以下三大类：

一、培养基及各种接种器皿灭菌不彻底：

（1）培养基：使用长菌的母液配制培养基；培养基pH值高、添加的有机成分均可导致细菌污染；培养基分装好后没有及时封口或封口后没有立即灭菌；培养容器口没有封严导致灭菌后细菌和真菌孢子再次进入培养容器使培养基污染；封口用的塑料盖、封口膜长时间在日光灯照射下易老化、破裂，导致密封性差，不慎使用后可能导致培养基污染；橡皮筋长时间在日光灯照射下也易松动、断裂，杂菌可能趁机进入培养容器；灭菌方法不当导致培养基污染；灭菌时间过短导致培养基灭菌不彻底；灭菌时间达到后立即打开灭菌锅，导致容器内压力差过大，使外部杂菌有可能被倒吸入容器中；过滤较多溶液后，滤膜过滤效果较差，使过滤后的溶液有菌，加入培养基后造成污染。

（2）培养容器和接种器具：培养容器不清洁；培养容器被污染后灭菌不彻底，再次使用时导致污染；高压灭菌锅或烘箱内培养容器、接种器具装得过满，影响灭菌效果；培养容器、接种器具灭菌时间过短导致灭菌不彻底；灭菌结束后立即打开高压灭菌锅或烘箱，强烈的冷热对流会导致冷空气被吸入包扎层内而重

新造成污染带菌。

二、外植体灭菌不彻底：

（1）外植体不清洁、生长不旺盛的部位材料带菌多；

（2）外植体表面积大的材料带带菌多；

（3）成年植株带菌多；生理年龄老的材料带菌多；

三、环境不清洁及人为因素：

（1）操作时人为带入（接种人员过长的指甲，双手未清洗干净，衣服和头发有很多灰尘，接种时不换拖鞋、接种服、帽子和口罩等）；

（2）环境不清洁；

（3）超净工作区域不清洁；

（3）环境湿度过大。培养材料的细菌性污染是指在培养基表面或材料表面出现黏液状物体、菌落或浑浊的水渍状。有时甚至出现泡沫发酵状的现象。细菌污染中以芽孢杆菌最普遍、最严重，常由高压灭菌锅未排尽冷空气、灭菌压力或温度不够、灭菌持续时间不够等造成。培养材料的真菌性污染是指在培养材料表面或培养基上出现菌丝，继而很快形成黑、白、黄、绿等孢子层。这种污染多是由空气、瓶口及瓶塞的真菌孢子所引起。

最后的第三点，我们来讨论防污染的对策。

（1）灭菌前充分排尽灭菌锅内冷空气，当灭菌锅压强达1.03×105~1.38×105Pa、温度为121~126℃时，应保持灭菌时间20~30min；

（2）接种器具每次使用后应用酒精灼烧或灭菌器灭菌；

（3）污染的外植体材料应及时淘汰，如果种源有限，对外植体材料可进行二次灭菌；

（4）操作人员接种时应用75%酒精擦拭双手和培养瓶表面，操作区内，不要放入过多待用培养瓶，防止气流被挡住；

（5）接种环境应定期用福尔马林等熏蒸灭菌，经常用紫外灯照射灭菌（严禁随意进出接种室和培养室；接种室和培养室定期用甲醛和高锰酸钾混合物进行空气熏蒸灭菌（甲醛4～6 mL·m-3，高锰酸钾3～6 g·m-3）；接种前应对接种室地面仔细清扫，用消毒水擦试地面、墙壁，并用70％酒精喷雾使空气中的灰尘沉降，超净工作台面用20％新洁尔灭或70％酒精棉仔细擦拭，并用紫外灯

照射20min，接种前20min使超净工作台处于工作状态进行充分过滤灭菌；接种室密闭、干净，最好选择在二层以上的楼房并与其它区域隔离开，地面和墙面的装饰材料应密闭光滑，便于擦洗消毒，安装拉门，减少开关门时空气的扰动。）；

（6）超净工作台应定期对初过滤器清洗和更换，提前15~20min打开紫外灯，并用75%酒精擦拭整个工作台；

（7）控制环境湿度（湿度应控制在70%左右，减少菌类过度繁殖）。