多菌灵降解菌的降解特性及GFP标记

多菌灵降解菌的降解特性及GFP标记
【摘要】：多菌灵(carbendazim，MBC)，化学名称为N-(2-苯并咪唑基)氨基甲酸甲酯，是一种高效广谱低毒的内吸性杀菌剂，属于苯胺类苯并咪唑衍生物，其使用范围较广，既可作为工业杀菌剂，又可作为一种有内吸活性的植物杀菌剂，用于水果保鲜、蔬菜、果树和谷类作物的病害防治。

多菌灵化学性质稳定，在土壤中降解半衰期较长，能持久地残留在使用部位，易致累积效应，其在水体和土壤中的累积会对生态环境和人类健康造成威胁。

有研究表明，微生物降解是沉积环境中多菌灵去除的主要途径。

因此寻找并研究多菌灵降解菌是十分必要的。

山西省农药重点实验室已分离筛选出一株细菌NY97-1，经试验证明该菌具有降解多菌灵的特性，若能进一步研究其降解能力、降解条件，为其在生物修复中的应用提供依据和实验材料，无疑具有重要的理论和现实意义。

绿色荧光蛋白(GFP)基因作为标记基因，被广泛应用于环境微生物学方面，由于其表达稳定，容易观测，因此，可以以GFP作为报告基因，对菌株NY97-1进行GFP标记，为今后研究多菌灵降解菌在自然环境中的定殖、分布及动态变化打下基础。

本文的主要研究内容有如下几个方面：1．该菌株NY97-1的16SrDNA经同源序列比对，同源性为99％以上，结合生理生化指标鉴定其属于短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus)。

2．经BamHI酶切的启动子探针载体pUC19-gfp与NY97-1基因组DNA的Sau3AI酶切片段酶连，酶连产物转化E．coliDH5a，建立B．p的启动子基因文库。

挑选其中的两
个强阳性克隆，亚克隆来自短小芽孢杆菌总基因组的启动子活性片段F4、F5，构建大肠杆菌-短小芽孢杆菌穿梭表达载体pNW33N-GFP4、pNW33N-GFP5。

通过电转化得到gfp在B．p中的两株标记菌株。

在荧光显微镜下，观察到了明亮的绿色荧光，证明活性片段F4、F5均具有组成型启动子的功能，实现了GFP基因在B．p中组成型表达，且遗传稳定，为今后研究多菌灵降解菌B．p在自然环境中的定殖、分布及动态变化打下了基础。

3．本文研究并建立了多菌灵在降解培养基中的残留检测方法。

该方法采用甲醇和水溶液的混合液作提取剂，检测结果表明：该方法的准确度、精密度和灵敏度等指标均符合农药残留分析的基本要求，同以往所报道的方法相比具有样品前处理过程相对简单，回收率高，重复性好，且费用较低等特点，适合于该降解菌的降解能力的检测。

4．本文对多菌灵降解菌株NY97-1的降解性能进行了研究。

结果表明：该菌株对多菌灵有较强的降解能力。

细菌菌株NY97-1在多菌灵浓度为100mg·L~(-1)的条件下，30℃振荡培养24h，多菌灵的降解率达78.66％。

外界条件对降解菌的降解也有显著影响。

培养基初始pH在6～10的范围内均可以高效降解多菌灵，pH为4时，对降解起较大的抑制作用。

在多菌灵的浓度为10～300mg·L~(-1)时，菌株NY97-1对多菌灵的降解率为42.44％～90.07％。

在35～40℃时对农药降解率最高，经高温高压处理后的菌液对多菌灵仍有降解作用，说明对降解起主要作用的物质耐热性好。

共存底物有机氮可以促进菌株NY97-1的降解能力，而无机氮源尿素对菌株NY97-1的降解能力起抑制作用。

5．实验证明菌株NY97-1
是一株多功能菌株，不仅具有降解多菌灵的功效，而且对多种枯萎菌具有拮抗效果。

对番茄枯萎菌(Fusariumoxysporum(Schl.)f.sp.Lycopersici(Sacc.)SnyderetHansen)、青椒枯萎菌(Fusariumoxysporum(Schl.)f.sp.vasinfectum(Snyd.etHans))、西瓜枯萎菌(Fusariumoxysporumf.sp.niveum(E.F.Smith)SnyderetHansen)、仙客来枯萎菌(Fusariumsp)、一品红枯萎菌(Fusariumsp)、黄瓜枯萎菌(Fusariumoxysporum(Schl.)f.sp.cucumerinumOwen)的抑制率分别为50.8％，50.8％，54.1％，37.5％，31.6％，42.5％。

6．多菌灵单剂对供试的六种枯萎菌菌丝生长具有明显的抑制效果，但10％的NY97-1活体菌液与多菌灵混配会降低多菌灵的毒力，表现为混配剂3d及7d 时EC_(50)均比多菌灵单剂的EC_(50)大。

这表明NY97-1与多菌灵共存时主要表现其降解作用。

该结果对指导NY97-1的合理使用有重要意义。

尽管其具有生防与降解双重功效，但在实际应用中仍以降解环境中残留的多菌灵进行生物修复为主。

7．研究了多菌灵处理土壤的盆栽黄瓜子叶期及开花期不同器官中超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)、ATP酶活性的变化。

结果表明多菌灵对花期不同器官中SOD、CAT、GPx、ATP酶活性所产生的诱导作用显著大于子叶期的。

多菌灵对花期根茎叶及子叶期叶中SOD活性诱导作用明显。

多菌灵对花期根叶及子叶期叶中CAT有明显的诱导作用，对花期茎及子叶期茎有明显的抑制作用。

而GPx花期及子叶期茎中有明显的诱导作用。

这说明随着黄瓜的生长其抵抗逆境的能力也在增强。

在子叶期，子叶在抵抗逆境的过程中发挥着重要
的作用。

【关键词】：多菌灵生物降解短小芽孢杆菌GFP标记抗氧化酶系统
【学位授予单位】：山西大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2007
【分类号】：X172
【目录】：中文摘要13-16英文摘要16-20第一章前言20-421.生物降解20-291.1微生物在生物圈进化中的作用201.2生物降解及生物降解能力20-211.3生物降解与微生物生理活性物质211.4检测生物降解能力的原则21-221.5利用环境样品和纯培养菌进行生物降解实验22-292.绿色荧光蛋白在环境微生物中的应用29-362.1绿色荧光蛋白简介292.2绿色荧光蛋白分子的结构及特性29-302.3绿色荧光蛋白的性质30-312.4绿色荧光蛋白的检测方法31-322.5绿色荧光蛋白在微生物降解污染物研究中的应用32-363.杀菌剂多菌灵研究进展36-403.1理化性质363.2生态毒理36-373.3多菌灵的残留检测方法37-393.4多菌灵的生物修复技术39-403.5多菌灵的降解机制404.本论文的研究目的重点及意义40-42第二章多菌灵降解菌NY97-1分类学地位的确定42-511.材料与方法42-481.1实验材料42-431.2形态特征及生理生化反应43-451.3以染色体DNA为模板PCR扩增
16SrDNA45-461.4以单菌落为模板PCR扩增16SrDNA46-482.结果48-502.1生理生化特性48-492.216SrDNA序列的NCBI在线BLAST 比对结果49-503.讨论50-51第三章NY97-1的绿色荧光蛋白标记51-581材料与方法51-531.1实验材料511.2主要试剂与仪器51-521.3NY97-1基因组DNA启动子基因文库的构建521.4强启动子片断的序列测定及分析521.5NY97-1组成型启动子活性片段的亚克隆及GFP基因穿梭表达载体的构建521.6重组DNA的电转化重组DNA的电转化52-531.7转化子的荧光检测531.8转化子的稳定性检测532.结果53-552.1启动子基因文库的构建532.2强启动子片断的测序分析532.3穿梭表达载体的构建53-542.4转化子的荧光检测与稳定性检测54-553.讨论55-58第四章NY97-1降解多菌灵的研究58-641.材料与方法58-601.1材料与仪器581.2多菌灵降解率的检测58-591.3菌悬液的制备591.4多菌灵浓度对菌株降解多菌灵的影响591.5氮源对菌株降解多菌灵的影响591.6pH值对菌株降解多菌灵的影响59-601.7培养温度对菌株降解多菌灵的影响602.结果60-622.1多菌灵标准曲线的绘制602.2多菌灵浓度对菌株降解多菌灵的影响60-612.3氮源对菌株降解多菌灵的影响612.4pH值对菌株降解多菌灵的影响61-622.5培养温度对菌株降解多菌灵的影响623.讨论62-634.结论63-64第五章NY97-1对多菌灵毒力的影响64-711.试验材料与方法64-651.1实验材料64-651.2菌株NY97-1对六种病原真菌的拮抗性能测定651.3多菌灵对六种病原真菌的毒力测定651.4低浓度多菌灵与NY97-1菌液混配对六种病原真菌的共同作用652.结果
65-672.1NY97-1对六种枯萎病原菌的拮抗效果65-672.2多菌灵单剂对六种枯萎病原菌的毒力测定结果672.3多菌灵与NY97-1菌液对六种枯萎病原菌的共同作用673.小节与讨论67-71第六章多菌灵对黄瓜抗氧化酶及ATP酶的影响71-791.材料与方法71-731.1仪器与试剂711.2试验设计71-721.3样品预处理及酶活性测定72-732.结果与分析73-752.1不同浓度多菌灵对黄瓜SOD活性的影响732.2不同浓度多菌灵对黄瓜CAT活性的影响73-742.3不同浓度多菌灵对黄瓜GP_X活性的影响74-752.4不同浓度多菌灵对黄瓜Na~+-ATP活性的影响752.5不同浓度多菌灵对黄瓜Mg~(2+)-ATP活性的影响753.讨论75-79第七章多菌灵降解菌的使用对多菌灵胁迫下黄瓜抗氧化酶及ATP酶的影响79-861.材料方法79-801.1供试土壤79-801.2供试菌株801.3杀菌剂多菌灵及其降解菌的使用801.4测定方法801.5数据处理802.结果与分析80-832.1降解菌的使用对黄瓜细菌蛋白的含量的影响80-812.2降解菌的使用对黄瓜SOD酶的影响812.3降解菌的使用对黄瓜CAT酶的影响81-822.4降解菌的使用对黄瓜ATP酶的影响82-833.讨论83-86第八章本文主要研究结论及展望86-901.本文主要研究结论86-881.1关于PCR扩增16SrDNA基因序列时模板的选择861.2GFP 标记的思路86-871.3菌株的多重功能——降解多菌灵与拮抗六种枯萎病原菌871.4多菌灵单剂及其与NY97-1活体菌液混合使用对六种枯萎病原菌的毒力871.5菌株NY97-1降解多菌灵的能力87-881.6多菌灵对黄瓜抗氧化酶的影响882.论文创新之处883.本文工作的重点及对今后工作的展望88-90参考文献90-107攻读博士期间发表的论。