脾气虚对大鼠睾丸生精细胞凋亡的影响
合集下载
相关主题
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
中国中医药科 技 ２ ０ １ ３年 ９月第 ２ Ｏ卷第 ５期 Ｓ ｅ ｐ ． ２ ０ １ ３ Ｖ ｏ １ ． ２ ０ Ｎ ｏ ． ５
・ ４ ４ ３・
脾 气 虚 对 大 鼠睾 丸 生精 细胞 凋 亡 的影 响
喻小明 赵 敏 徐安莉 周艳 艳 周安 方 陈会敏
（ 湖北 中医药大 学 ・ 武汉 ４ ３ ０ ０ ６ ５ ）
列在相应的峰道 内。１ ｃ峰 ： 单 倍体 Ｄ Ｎ Ａ细 胞群 ， 包括 精子 细胞和精子 ； ２ Ｃ峰 ： 二倍 体 Ｄ Ｎ Ａ细胞 群 ， 主要 包括 Ｇ ０ 期精
１ ． １ 实验 动物 与分 组
选 用体重 （ ２ ０ ０． ４ － ２ ０） ｇ 雄 性 Ｗｉ ｓ ｔ ａ ｒ
大鼠４ ０只 ， Ｓ Ｐ Ｆ级 ， 由华 中科技大 学同济 医学院实验 动物 中 心提供 ， 动物合格证 号 ： Ｓ Ｃ Ｘ Ｋ（ 鄂） ２ ｏ ｏ ４—０ ０ ０ ７ 。随机分为 正 常组 、 ２ １ 天模 型组 、 ３ ５天模型组及 ５ Ｏ天模 型组 ， 每组 １ ０只 。 大 鼠 自由饮水和采食 ， 室温（ ２ ５±１ ） ℃， 光照明暗各 １ ２小时 ， 适 应性 喂养 １周后进行实验 。
悬液 。取睾丸组织 约 １ ｇ剪 碎 ， 加入 ０ ． ２ ５ ％胰 蛋 白酶 ３ ｍ ｌ ，
３ ７ ℃水 浴 ２ ５分 钟 ， ３ ０ ０ 目尼龙 网过滤 ， 取滤液， １ ５ ０ ０ ｒ ／ ｍ ｉ ｎ
＜Ｏ ． ０ ５，｝ Ｐ＜ Ｏ ． ０ １ ； 与３ ５天模 型组 比较△Ｐ＜０ ． ０ ５
２ ． ２ 各 组 大 鼠 各 级 生 精 细 胞 百 分 比的 比 较
见表 ２ 。
离心 １ ０分钟 ， 弃上清 ， 然后 加入 Ｐ Ｂ Ｓ ３ ｍ ｌ ， 振荡， １ ５ ０ ０ ｒ ／ ｍ ｉ ｎ 离心 １ ０分钟 ， 去上清 ， 再 次加入 Ｐ Ｂ Ｓ ３ ｍ ｌ 振荡后 １ ５ ０ ０ ｒ ／ ｍ ｉ ｎ 离心 １ ０分钟 ， 去上清， 加入 ３ ｍ ｌ ４ ℃７ ０ ％ 乙醇 封 存 于冰 箱 中 。３天后离心 出细胞液 ， 用Ｐ Ｂ Ｓ稀 释细胞 数致 １×１ ０ 。个／
１ ． ６ 统计学分析 使用 Ｓ Ｐ Ｓ Ｓ １ ０ ． ０统计软件进行方差分析。
２ 结 果
附属门诊部提供 ， 水煎制成含生药量 ０ ． ２ ｇ ／ ｍ ｌ 的混悬 液。 １ ． ３ 动物模 型的建立 每 日上午 以 １ ． ５ ｍ ｌ ／ ｌ Ｏ Ｏ ｇ 体重灌 胃大黄水煎 液 １次 ， 每 日下
鼠睾丸凋亡细胞数及 各级生精 细胞百分 比。结果 ： 正常组 出现低平 的凋亡峰 ，各模 型组 出现明显的凋 亡 峰， 且 随着造模 时间的延 长凋亡峰 增 高。各模型 组 １ ｃ和 ４ ｃ生精 细胞 百分 比较 正 常组 明显 降低 ， 以５ ０ 天模型组为甚 。结论 ： 脾 气虚 可引起 睾丸生精 细胞大量凋亡 ， 各级生精 细胞数量减 少， 这可能是脾 气虚 引
原细胞 、 次级 精母 细胞 ； ４ Ｃ峰 ： 四倍 体 Ｄ Ｎ Ａ细胞 群 ， 主要包 括初级精母细胞 、 Ｇ 期精原细胞。若在 ｌ ｃ峰前 面 出现一个
显著 的峰 即为凋亡 细胞 峰 Ｊ 。
１ ． ２ 药物及 制备
大黄水煎 液 ： 生 大黄 由湖北 中医药 大学 采用苦寒 泻下加劳倦过度法 。即
荧 光显微镜下观察 ， 若 细胞核呈 明亮的橙红 色荧 光 ， 即 可上
正常生精过程 中， 但 若生 精细胞大量 凋亡 ， 则会 导致 生精 障 碍ｎ ］ 。本实验通过建立大 鼠脾气虚 的动物模 型 ， 采用流式细 胞仪（ Ｆ Ｃ Ｍ） 检测 模 型动 物生精 细胞 凋亡 状况 ， 从 而 探讨 脾
气虚引起不育 的病理 机制。
１ 材 料 与 方 法
机分析 。每份标本检 测细胞 数为 ２ ０ ０ ０ ０ 。实验数 据采用 细
胞仪附带 的软件进行 分析。
１ ． ５ 观 察指标检 测 采 用 Ｆ Ａ Ｃ Ｓ ４ ２ ０型流式 细胞仪 （ 美 国 Ｂ Ｄ公司 ） 对睾 丸生 精 细胞单 细胞 悬液进 行定 量分析 ， 每份 标本检测细胞数为 ２ ０ ０ ０ ０ 。在 Ｆ Ｃ Ｍ分析 的细胞分 布直方 图 上， 正常睾丸组织 由 ３类细胞群组成 ， 就其 Ｄ Ｎ Ａ含 量分别排
起 睾丸 生精功 能障碍从而 导致 不育的根 本机 制。
主题词 不 育症 ／ 中 医病机 脾 气虚 生 精 细胞 细胞 凋亡 大鼠 男（ 雄性 ）
脾 气虚是引起男 性不育 的主要原 因之一 ， 迄 今为 止 ， 脾 气虚 引起不育的病理 机制 尚未完全 阐明。细胞 凋亡 存在 于
Ｔ Ｔ ｌ ｌ ， 常温下 Ｐ Ｉ 染色 １ ５～ ２ ０分钟 ， ４ ２ ０目筛 网过滤 ， 取 １滴 在
摘
要 目的 ： 观察脾气虚对大鼠睾 丸生精 细胞凋亡的影响 ， 探 讨脾 气虚 引 起 不育 的病理机 制。方法： 选
用雄性 Ｗｉ ｓ ｔ ａ ｒ大鼠４ ｜ Ｄ 只， 随机 分为正常组 、 脾 气虚 ２ １天模型组 、 ３ ５天模 型组及 ５ ０天模 型组。采 用双 因
素 复合 法即苦Leabharlann Baidu泻下加 劳倦 过度法 （ 大黄 灌 胃 加 游泳 法） 建 立脾 气虚模 型 ， 流式 细胞 术分别检 测各组 大
１ ． ４ 标本的采集与处理
睾 丸生精细胞单细胞 悬液 的制备 ： 给药 结束 后次 １ ３， 处 死 大鼠 ， 取大 鼠左侧 睾丸组 织 ， 按照文献 ＂ 方法 ， 制备单细胞
与 正 常组 比较＃ Ｐ＜０ ． ０ ５， ＃ ＃ Ｐ＜０ ． ０ １ ； 与２ １天 模 型组 比较 ｛ Ｐ
午让大 鼠负 重游泳 １次（ 于大 鼠尾根部缠绕重量为该大 鼠体 重 １ ０ ％ 的保险丝 ， 将其放入水深 ５ ０ ｃ ｍ、 水 温（ ２ ０±５ ） ℃的水
２ ． １ 各组大鼠睾丸生精 细胞 凋亡率测定
表１
见表 １ ， 图１ 。
各组大 鼠生精细胞凋亡率的比较 （ ±ｓ ）
槽 中游 泳 ， 至力竭为度 （ 大 鼠鼻尖没入水面 １ Ｏ秒 ）
・ ４ ４ ３・
脾 气 虚 对 大 鼠睾 丸 生精 细胞 凋 亡 的影 响
喻小明 赵 敏 徐安莉 周艳 艳 周安 方 陈会敏
（ 湖北 中医药大 学 ・ 武汉 ４ ３ ０ ０ ６ ５ ）
列在相应的峰道 内。１ ｃ峰 ： 单 倍体 Ｄ Ｎ Ａ细 胞群 ， 包括 精子 细胞和精子 ； ２ Ｃ峰 ： 二倍 体 Ｄ Ｎ Ａ细胞 群 ， 主要 包括 Ｇ ０ 期精
１ ． １ 实验 动物 与分 组
选 用体重 （ ２ ０ ０． ４ － ２ ０） ｇ 雄 性 Ｗｉ ｓ ｔ ａ ｒ
大鼠４ ０只 ， Ｓ Ｐ Ｆ级 ， 由华 中科技大 学同济 医学院实验 动物 中 心提供 ， 动物合格证 号 ： Ｓ Ｃ Ｘ Ｋ（ 鄂） ２ ｏ ｏ ４—０ ０ ０ ７ 。随机分为 正 常组 、 ２ １ 天模 型组 、 ３ ５天模型组及 ５ Ｏ天模 型组 ， 每组 １ ０只 。 大 鼠 自由饮水和采食 ， 室温（ ２ ５±１ ） ℃， 光照明暗各 １ ２小时 ， 适 应性 喂养 １周后进行实验 。
悬液 。取睾丸组织 约 １ ｇ剪 碎 ， 加入 ０ ． ２ ５ ％胰 蛋 白酶 ３ ｍ ｌ ，
３ ７ ℃水 浴 ２ ５分 钟 ， ３ ０ ０ 目尼龙 网过滤 ， 取滤液， １ ５ ０ ０ ｒ ／ ｍ ｉ ｎ
＜Ｏ ． ０ ５，｝ Ｐ＜ Ｏ ． ０ １ ； 与３ ５天模 型组 比较△Ｐ＜０ ． ０ ５
２ ． ２ 各 组 大 鼠 各 级 生 精 细 胞 百 分 比的 比 较
见表 ２ 。
离心 １ ０分钟 ， 弃上清 ， 然后 加入 Ｐ Ｂ Ｓ ３ ｍ ｌ ， 振荡， １ ５ ０ ０ ｒ ／ ｍ ｉ ｎ 离心 １ ０分钟 ， 去上清 ， 再 次加入 Ｐ Ｂ Ｓ ３ ｍ ｌ 振荡后 １ ５ ０ ０ ｒ ／ ｍ ｉ ｎ 离心 １ ０分钟 ， 去上清， 加入 ３ ｍ ｌ ４ ℃７ ０ ％ 乙醇 封 存 于冰 箱 中 。３天后离心 出细胞液 ， 用Ｐ Ｂ Ｓ稀 释细胞 数致 １×１ ０ 。个／
１ ． ６ 统计学分析 使用 Ｓ Ｐ Ｓ Ｓ １ ０ ． ０统计软件进行方差分析。
２ 结 果
附属门诊部提供 ， 水煎制成含生药量 ０ ． ２ ｇ ／ ｍ ｌ 的混悬 液。 １ ． ３ 动物模 型的建立 每 日上午 以 １ ． ５ ｍ ｌ ／ ｌ Ｏ Ｏ ｇ 体重灌 胃大黄水煎 液 １次 ， 每 日下
鼠睾丸凋亡细胞数及 各级生精 细胞百分 比。结果 ： 正常组 出现低平 的凋亡峰 ，各模 型组 出现明显的凋 亡 峰， 且 随着造模 时间的延 长凋亡峰 增 高。各模型 组 １ ｃ和 ４ ｃ生精 细胞 百分 比较 正 常组 明显 降低 ， 以５ ０ 天模型组为甚 。结论 ： 脾 气虚 可引起 睾丸生精 细胞大量凋亡 ， 各级生精 细胞数量减 少， 这可能是脾 气虚 引
原细胞 、 次级 精母 细胞 ； ４ Ｃ峰 ： 四倍 体 Ｄ Ｎ Ａ细胞 群 ， 主要包 括初级精母细胞 、 Ｇ 期精原细胞。若在 ｌ ｃ峰前 面 出现一个
显著 的峰 即为凋亡 细胞 峰 Ｊ 。
１ ． ２ 药物及 制备
大黄水煎 液 ： 生 大黄 由湖北 中医药 大学 采用苦寒 泻下加劳倦过度法 。即
荧 光显微镜下观察 ， 若 细胞核呈 明亮的橙红 色荧 光 ， 即 可上
正常生精过程 中， 但 若生 精细胞大量 凋亡 ， 则会 导致 生精 障 碍ｎ ］ 。本实验通过建立大 鼠脾气虚 的动物模 型 ， 采用流式细 胞仪（ Ｆ Ｃ Ｍ） 检测 模 型动 物生精 细胞 凋亡 状况 ， 从 而 探讨 脾
气虚引起不育 的病理 机制。
１ 材 料 与 方 法
机分析 。每份标本检 测细胞 数为 ２ ０ ０ ０ ０ 。实验数 据采用 细
胞仪附带 的软件进行 分析。
１ ． ５ 观 察指标检 测 采 用 Ｆ Ａ Ｃ Ｓ ４ ２ ０型流式 细胞仪 （ 美 国 Ｂ Ｄ公司 ） 对睾 丸生 精 细胞单 细胞 悬液进 行定 量分析 ， 每份 标本检测细胞数为 ２ ０ ０ ０ ０ 。在 Ｆ Ｃ Ｍ分析 的细胞分 布直方 图 上， 正常睾丸组织 由 ３类细胞群组成 ， 就其 Ｄ Ｎ Ａ含 量分别排
起 睾丸 生精功 能障碍从而 导致 不育的根 本机 制。
主题词 不 育症 ／ 中 医病机 脾 气虚 生 精 细胞 细胞 凋亡 大鼠 男（ 雄性 ）
脾 气虚是引起男 性不育 的主要原 因之一 ， 迄 今为 止 ， 脾 气虚 引起不育的病理 机制 尚未完全 阐明。细胞 凋亡 存在 于
Ｔ Ｔ ｌ ｌ ， 常温下 Ｐ Ｉ 染色 １ ５～ ２ ０分钟 ， ４ ２ ０目筛 网过滤 ， 取 １滴 在
摘
要 目的 ： 观察脾气虚对大鼠睾 丸生精 细胞凋亡的影响 ， 探 讨脾 气虚 引 起 不育 的病理机 制。方法： 选
用雄性 Ｗｉ ｓ ｔ ａ ｒ大鼠４ ｜ Ｄ 只， 随机 分为正常组 、 脾 气虚 ２ １天模型组 、 ３ ５天模 型组及 ５ ０天模 型组。采 用双 因
素 复合 法即苦Leabharlann Baidu泻下加 劳倦 过度法 （ 大黄 灌 胃 加 游泳 法） 建 立脾 气虚模 型 ， 流式 细胞 术分别检 测各组 大
１ ． ４ 标本的采集与处理
睾 丸生精细胞单细胞 悬液 的制备 ： 给药 结束 后次 １ ３， 处 死 大鼠 ， 取大 鼠左侧 睾丸组 织 ， 按照文献 ＂ 方法 ， 制备单细胞
与 正 常组 比较＃ Ｐ＜０ ． ０ ５， ＃ ＃ Ｐ＜０ ． ０ １ ； 与２ １天 模 型组 比较 ｛ Ｐ
午让大 鼠负 重游泳 １次（ 于大 鼠尾根部缠绕重量为该大 鼠体 重 １ ０ ％ 的保险丝 ， 将其放入水深 ５ ０ ｃ ｍ、 水 温（ ２ ０±５ ） ℃的水
２ ． １ 各组大鼠睾丸生精 细胞 凋亡率测定
表１
见表 １ ， 图１ 。
各组大 鼠生精细胞凋亡率的比较 （ ±ｓ ）
槽 中游 泳 ， 至力竭为度 （ 大 鼠鼻尖没入水面 １ Ｏ秒 ）