cPTEN+蛋白的表达与肝癌生物学行为的关系

FAK Ezrin 和PTEN 蛋白的表达与肝癌生物学行为的关系*
黄海花①
吴秀浅②郑志超①张薇①
摘要
目的：
探讨肝癌中Ezrin 、FAK 和PTEN 的表达及其与肝癌发生及进展的关系。

方法：应用免疫组织化学SP 法原位观察上述3个蛋白在正常肝组织、肝癌及相应癌旁组织中的表达，分析其与各临床病理参数间的关系。

结果：1）Ezrin 、FAK 和PTEN 在肝癌中的阳性表达率分别为66.00%、48.00%及64.00%。

2）Ezrin 和FAK 在肝癌组织中的阳性表达率明显高于正常肝组织（P <
0.05，
P <0.01），PTEN 则相反，其在肝癌组织中的阳性表达率明显低于相应的癌旁组织及正常肝组织（P <0.01）。

Ezrin 和PTEN 的表达均与肝癌的组织分级、血管浸润及卫星灶有关（P <0.05，P <0.01）。

FAK 的表达与血管浸润及卫星灶有关（P <0.05，P <0.01），但与组织学分级及肝硬化无关。

Ezrin 、FAK 及PTEN 的表达均与患者的年龄、性别和肿瘤大小无关（P >0.05）。

3）Ezrin 与FAK 的表达呈正相关（r =0.445，P =0.001），Ezrin 和FAK 均与PTEN 的表达呈负相关（r =-0.475，P =0.001；r =-0.364，P =0.009）。

结论：Ezrin 和FAK 过表达与PTEN 表达的下调，可能在肝癌的发生和浸润过程中扮演重要角色。

三者的异常表达可能是肝癌发生的一个信号。

关键词
肝细胞肝癌免疫组织化学骨架连接蛋白粘着斑激酶浸润
doi:10.3969/j.issn.1000-8179.2011.14.004
Significance of FAK,Ezrin,and PTEN Expression in Hepatocellular Carcinoma
Haihua HUANG 1,Xiuqian WU 2,Zhichao ZHENG 1,Wei ZHANG 1
Correspondence to:Xiuqian WU,E-mail:wuxiuqian7311@
1Department of Pathology,Second Affiliated Hospital of Shantou University Medical College,Shantou 515041,China 2
Department of Interventional Therapy,Tumor Hospital of Medical College of Shantou University,Shantou 515041,China
This work was supported by a grant from the Key Technology Projects in Shantou City (No.shan Fu Ke[2009]No70-2)
Abstract
Objective:To investigate the protein expression of the membrane cytoskeleton cross linker protein (Ezrin),focal adhe-
sion kinase (FAK ),and phosphates and tensin homolog deleted on chromosome ten (PTEN )in hepatocellular carcinoma (HCC)and determine their relationships.Methods:The expression profiles of Ezrin,FAK,and PTEN in 20cases of normal liver tissues,50cases of HCC,and adjacent hepatic tissues were investigated in situ via SP immunohistochemistry (IHC ).The relationship between the ex-pression profile and the biological behavior of HCC development and invasion was also analyzed.Results:The protein expression lev-els of Ezrin and FAK were significantly higher in HCC than in normal liver tissues (P <0.05and P <0.01,respectively ).At a high Ez-rin concentration,an FAK expression level was observed in 33(66.0%)HCC and 24(48.0%)normal cases .The strong expression of Ezrin (P <0.05)and FAK (P <0.01)were significantly correlated with histological grade,vascular invasion,and HCC satellite le-sions.On the other hand,in 32of 50cases (64.0%),a significantly lower PTEN level was found in the HCC tissue compared with those of adjacent hepatic tissues and normal liver tissues (P <0.01).No correlation between histological grade and liver cirrhosis was observed,even though the expression level of FAK was associated with vascular invasion and satellite lesions (P <0.05or P <0.01).Furthermore,no correlation between the Ezrin,FAK,and PTEN expression levels and patient age,gender,and tumor size was observed (P >0.05).A significant positive relationship was found between Ezrin and FAK expressions (r =0.445,P =0.001),and an inverse correlation was detected between the expression of Ezrin and PTEN (r =-0.475,P =0.001)and FAK and PTEN (r =-0.364,P =0.009).Conclusion:Further studies need to be conducted to fully understand the strong expression of Ezrin and FAK,the weak expres-sion of PTEN,and the underlying mechanism of HCC invasion and metastasis.In addition,a novel association between the abnormal expression of Ezrin,PTEN,and FAK and hepatocarcinogenesis possibly exists.
Keywords
Hepatocellular carcinoma;Immunohistochemistry;Ezrin;Focal adhesion kinase;Invasion
作者单位：①汕头大学医学院第二附属医院病理科（广东省汕头市515041）；②汕头大学医学院附属肿瘤医院介入科 本文课题受汕头市重点科技计划项目（编号：汕府科［2009］70号-2）资助
我国是肝癌的高发区，2008年男性的发病率是
37.4/10万人，女性为13.7/10万人［1］。

该肿瘤具有发
病率高、进展快、转移早及预后差等特点。

治疗方法
主要采用以外科手术为主的综合治疗模式［2］，
虽然通过外科手术有效的提高了患者的生存率，但肝癌术后的复发及转移率仍然较高［3］，即使是小肝癌也存在这个问题。

因此肝癌的治疗需要新的思路和方法，这一切有赖于对肝癌发生及侵袭转移机制研究的突
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破。

侵袭转移是恶性肿瘤重要的生物学特征，其发生的每一环节均需黏附分子的参与［4］，黏附分子及其介导的信号通路贯穿于肿瘤发生进展的全过程。

FAK（focal adhersion kinase）和细胞骨架连接蛋白（membrane cytoskeleton cross linker protein，Ezrin）是影响细胞间及细胞与基质间黏附作用的重要分子，第10条染色体上缺失的与张力蛋白同源的磷酸酶（phosphatase and tensin homolog deleted on chromo⁃some ten，PTEN）是与这2个蛋白介导的信号传导通路相关的抑癌基因，对其之间相互作用机制的深入研究将有助于进一步阐明肝癌的发生及浸润转移机制。

目前有关Ezrin、FAK和PTEN及三者间的相关性与肝癌生物学行为的关系尚缺乏研究，因此本研究拟通过联合检测三者在正常肝组织、癌旁组织及肝癌组织中的表达，分析它们与各临床病理参数间的关系及其之间的相关性，判断三者在肝癌发生发展中的作用和相关机制。

1材料与方法
1.1标本来源
收集我院普外科1998年6月至2009年6月肝癌手术标本50例，对应的癌旁肝组织50例（取自离癌边缘2.0cm以外的肝组织）。

肝癌患者年龄27～88岁，平均年龄54.4岁；男性37例，女性13例。

采用经典的Edmondson四级分级法［5］进行组织学分级：Ⅰ级5例，Ⅱ级17例，Ⅲ级23例，Ⅳ级5例。

肿瘤直径≤2.0cm小肝癌2例，2.0～5.0cm12例，>5.0cm36例。

正常肝组织20例，取自肝血管瘤或肝囊肿术后标本。

所有病例术前均未进行任何化学和放射治疗，术后均经病理诊断证实。

50例癌旁组织中32例有不同程度的肝硬化改变。

1.2标本处理
所有标本均用10.0%中性福尔马林固定、常规脱水、石蜡包埋及切片，片厚4.0μm。

1.3试剂和方法
兔抗人Ezrin单克隆抗体及兔抗人PTEN多克隆抗体购自上海太阳生物技术有限公司，为即用型产品。

鼠抗人FAK单克隆抗体为美国Santa Cruz公司产品，为浓缩型抗体，一抗稀释度为1：100，购自北京中杉金桥生物有限公司。

SP试剂盒及DAB显色试剂盒为上海太阳生物技术有限公司产品。

PBS（0.01mol/L，pH7.4）代替一抗做阴性对照，用已知阳性片做阳性对照。

免疫组织化学染色采用SP法，染色步骤按说明书进行。

1.4结果判断
Ezrin定位于细胞膜或细胞质内，PTEN及FAK阳性均定位于胞质中，部分病例PTEN定位于细胞核上。

参照Mathew等［6］的分级方法进行阳性程度分级：（-）为无表达；（+）为阳性细胞数<10%或染色呈浅黄色；（++）为阳性细胞数≥50%或染色呈棕黄色；为方便统计将（+）和（++）合并为有阳性表达。

1.5统计学分析
所有实验数据采用SPSS11.5统计软件分析处理。

组间的比较采用行×列表χ2检验，FAK、Ezrin和PTEN间相关性检验采用Spearman相关分析，以P< 0.05为差异有统计学意义。

2结果
2.1Ezrin蛋白的表达与肝癌临床病理特征间的关系
由表1可见，20例正常肝组织中8例表达Ezrin蛋白，但胞质着色均较淡，1例表达较强，50例癌旁组织中28例有Ezrin蛋白的表达，其中13例呈强阳性表达，特别在伴有慢性炎症及肝硬化的癌旁组织中Ez⁃rin蛋白的表达强。

50例肝细胞癌中Ezrin呈阳性表达33例，有23例为强阳性表达，其中部分呈弥漫强阳性表达。

癌旁间质中增生的小胆管、浸润的淋巴细胞、浆细胞及纤维细胞均见Ezrin蛋白的表达。

χ2检验结果发现，肝癌组Ezrin蛋白的表达明显高于正常肝组织组（χ2=3.980，P=0.046）。

Ezrin蛋白的阳性表达率随细胞分化程度的降低而升高（χ2=4.482，P= 0.034）。

伴有血管浸润、卫星灶及肝硬化的肝癌组织中Ezrin蛋白表达均明显高于无伴有上述病变的肝癌组织（χ2=4.388，P=0.015；χ2=4.227，P=0.040；χ2=5.824，P=0.016）。

2.2FAK蛋白的表达与肝癌临床病理特征间的关系
如表1所示，20例正常肝组织中仅1例弱表达FAK 蛋白，癌旁组织FAK的阳性表达率为40.00％（20/50），其中8例呈强阳性表达，肝癌组FAK蛋白的阳性表达率为48.00%（24/50），其中呈强阳性表达18例。

χ2检验结果发现，正常肝组织与肝癌组（P=0.001）、正常肝组织与癌旁组间（P=0.004）FAK蛋白表达的差异有统计学意义。

伴有血管浸润及卫星灶的肝癌组织中FAK的阳性表达率明显高于无伴有上述病变的肝癌组织（χ2=6.872，P= 0.009；χ2=8.365，P=0.004）。

FAK蛋白在肝癌组织中的表达与是否伴有肝硬化无关（χ2=1.299，P=0.245）。

FAK 蛋白的阳性表达率与肝癌细胞的分化程度无关（χ2=1.719，P=0.190）。

2.3PTEN蛋白的表达与肝癌临床病理特征间的关系
从表1可见，20例正常肝组织中有19例表达PTEN 蛋白，其中18例呈弥漫强阳性表达。

50例癌旁组织中48例表达PTEN蛋白，其中36例呈强阳性表达，部分呈弥漫性表达。

50例肝癌组织中有32例表达PTEN蛋白，其中弱阳性表达19例，强阳性表达为13例，多为灶性表达。

另外发现少数病例PTEN蛋白既表达于胞质中也表达于细胞核上，癌旁增生的小胆管也有PTEN蛋白
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表达。

χ2检验结果发现，正常肝组织与肝癌组PTEN蛋白表达的差异有统计学意义（χ2=6.942，P=0.008），但正常肝组织与癌旁组间的差异无统计学意义（χ2=0.035，P=0.852）。

伴有血管浸润及卫星灶的肝癌组织中PTEN
蛋白的表达率明显低于无伴有上述病变的肝癌组织，但PTEN的表达与是否伴有肝硬化无关（χ2=2.317，P=0.128）。

PTEN蛋白的阳性表达与肝癌的组织学分级有关，随着分级的增加，表达下调（χ2=5.414，P=0.020）。

2.4Ezrin、PTEN及FAK蛋白的表达与肝癌患者性别、年龄及肿瘤直径的关系
结果发现三者的表达均与患者的年龄、性别及肿瘤直径无关，各组间的χ2检验结果P均>0.05（表1）。

2.5Ezrin、FAK及PTEN蛋白在肝癌组织中表达的相关性
Spearman相关分析结果发现，50例肝癌组织中，Ezrin与FAK蛋白的表达呈正相关（r=0.445，P= 0.001），Ezrin与PTEN的表达呈负相关（r=-0.475，P= 0.001），FAK与PTEN蛋白的表达亦呈负相关（r=-0.364，P=0.009）。

表1Ezrin、FAK和PTEN蛋白表达与肝癌临床病理特征的关系例（%）
Table1Relationship of the expression of Ezrin，FAK and PTEN with the clinicopathological features of hepatocellular carcinoma（%）
3讨论
Ezrin是ERM（ezrin-radixin-moesin）细胞骨架相关蛋白家族的重要成员之一，是细胞膜和细胞骨架的重要连接者，不但具有重要的生理功能，如维持细胞形态、调节细胞活力、生存、黏附和迁移，而且与肿瘤的侵袭、转移关系密切［7-8］。

FAK是1992年Schalle 等［9］在V-Src转染的鸡胚细胞中发现的与细胞黏附关系密切的非受体型酪氨酸激酶，在整合素及生长因子受体介导的信号传导通路中起枢纽作用［10］。

在人类多种不同来源的肿瘤中均存在FAK的过度表达或激活，其与Ezrin一样参与细胞的活力和生存的调节，并在肿瘤的发生、侵袭转移、预后预测及肿瘤多药耐药等方面扮演重要角色，是一有发展前景的肿瘤治疗新靶点。

FAK的活化形式为酪氨酸磷酸化，其最重要的磷酸化位点为Tyr397。

Poullet等［11］发现在悬浮生长的肾来源上皮LLC-PK1细胞中，过度表达的Ezrin蛋白能促进FAK主要的自动磷酸化位点
Tyr397的磷酸化。

另外Ezrin蛋白还可通过活化FAK 和MAPK途径，促进粘着斑的形成及肿瘤细胞与其他细胞、间质组织的黏附［12］，过度表达的Ezrin可使细胞与细胞及细胞与细胞外基质间的黏附能力下降，促进细胞的迁移。

PTEN是近年来发现的一个定位于人染色体10q23.3的唯一具有磷酸酯酶活性的抑癌基因，可参与粘着斑的形成和解聚，从而影响细胞迁移。

另外可通过复杂的信号传导网络如PI3K/AKT/ PKB、FAK和MAPK等来调节细胞的生长、增殖、分化、凋亡、黏附、迁移和血管生长等。

PTEN不但能使蛋白激酶Shc和FAK，还能使PIP3脂质去磷酸化，
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中国肿瘤临床2011年第38卷第14期
而抑制相关信号通路。

在脑星形胶质细胞瘤的研究中发现，PTEN可通过逆转FAK的磷酸化或作用于
FAK下游的效应分子，如Cas和Shc来调控细胞的迁移［13］。

PTEN基因的突变及失活已证明与多种肿瘤的发生发展密切相关［14-16］。

由此可见Ezrin、FAK及PTEN均可通过粘着斑互相联系，同时可通过共同的信号通路相互作用，促进肿瘤的发生、浸润及转移。

本研究结果显示Ezrin与FAK的表达呈正相关，Ezrin 和FAK与PTEN蛋白的表达均呈负相关，提示Ezrin 和FAK蛋白的高表达与PTEN蛋白的低表达可能共同参与了肝癌的发生及侵袭转移。

Yeh等［17］的研究发现在伴有乙型肝炎的肝癌组织中存在Ezrin的高表达，其过表达与细胞的去分化、血管浸润、肝硬化及肿瘤体积小等密切相关。

本组研究结果也发现肝癌组织中Ezrin的阳性表达率明显高于正常肝组织，在伴有慢性肝炎及肝硬化的癌旁组织中，Ezrin多呈弥漫强阳性表达。

随着细胞分化的降低，Ezrin的阳性表达率升高，差异有统计学意义。

另外Ezrin的高表达与血管浸润、卫星灶及肝硬化有关，但与肿瘤的大小无关，上述结果提示Ezrin的高表达可能与肝癌的发生、细胞分化及侵袭转移有关。

有研究提示PI3K-AKT-mTOR通路的激活与肝癌的发生发展有关，Ezrin活性的增加可导致PI3K-AKT-mTOR活性的增加，使肝细胞系Hep3B细胞去分化，另外Ezrin可通过激活PI3K/AKT通路来调控上皮细胞的存活，因此Ezrin可能通过PI3K-AKT-mTOR通路使肝癌细胞去分化［18］。

另外有研究表明Ezrin蛋白在肿瘤及非肿瘤组织中的定位有差异，如在不典型增生的子宫内膜组织中Ezrin定位于胞质，在子宫内膜腺癌中定位于细胞膜和细胞质，在转移组织中则表达于细胞膜上［19］。

但在正常结肠组织中Ezrin定位于细胞膜上，在癌中则定位于胞质上。

在十二指肠内容物返流诱导的食管鳞状细胞癌的动物模型研究中发现，癌组织中存在Ezrin过表达，其不仅表达于细胞膜及细胞质中，而且存在核的表达［20］，但本组研究未发现Ezrin蛋白在肝癌及癌旁肝组织中的定位有差异，提示Ezrin蛋白在细胞中定位的改变可能与肝癌的生物学行为无关。

但有趣的是，在癌旁增生的小胆管有Ezrin蛋白的表达，且定位于细胞膜。

因此对于Ezrin蛋白定位的差异是否与肿瘤的发生和转移有关，需要对各种不同组织来源肿瘤做进一步的研究和分析，方能得出有信服力的结论。

有研究表明，过度表达的PTEN能抑制细胞的迁移，野生型PTEN能下调整合素介导的细胞伸展和粘着斑的形成，PTEN能与粘着斑激酶相互作用并减少其酪氨酸磷酸化，而过度表达的FAK能部分对抗PTEN的作用，因此PTEN可能通过负性调控FAK介导的信号传导通路，影响细胞与细胞外基质的相互作用，发挥其抑癌作用［21］。

本组结果发现肝癌组织中FAK的阳性表达率明显高于正常肝组织，而PTEN 则相反，其在肝癌中的阳性表达率明显低于癌旁及正常肝组织，两者间的表达呈负相关，提示FAK可能在肝癌的发生发展中起促进作用，而PTEN则相反。

另外FAK和PTEN的表达均与血管浸润及卫星灶有关，PTEN的表达还与细胞分化密切相关，FAK则与细胞分化无关。

上述结果提示FAK过表达与PTEN 表达下调可能参与了肝癌的发生及浸润，PTEN可能还参与了肿瘤细胞的分化。

综上所述，Ezrin和FAK的高表达及PTEN基因的低表达可能参与了肝癌的发生及浸润等生物学行为，可能的机制是Ezrin和FAK间通过粘着斑和细胞骨架的连接参与细胞表面复合物的形成，过度表达的Ezrin激活了FAK，FAK则进一步活化下游的信号传导通路，促进细胞的增殖、侵袭和转移，同时过度激活的FAK能部分对抗抑癌基因PTEN的抑癌作用，同时PTEN表达的下调降低其对FAK磷酸化的抑制，从而促进细胞的侵袭和转移。

有关Ezrin、FAK及PTEN三者在肝癌中的转录水平及涉及的具体传导通路及调节的细节仍需进一步研究。

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