柱前衍生化_高效液相色谱法测定牛磺酸的条件优化

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柱前衍生化—高效液相色谱法测定牛磺酸的条件优化
黄晓杰1，李京华2，王俊德2*
1.辽宁医学院 食品学院 （锦州 121001）；
2.大连化物所 （大连 116023）
摘要采用自行制备的反相高效液相色谱柱，以2，4-二硝基氟苯为衍生化试剂，色谱条件为：流动相醋酸钠缓冲溶液-乙腈（体积比875∶125），检测波长360 nm，外标法定量。

得到最佳衍生条件为4.36 µmol牛磺酸和0.4% DNFB 0.1 mL，pH=7。

对鲍鱼样品进行了测定，测得鲍鱼中牛磺酸含量1.12 g/100 g，此方法回收率与精密度试验结果较好。

关键词反相高效液相色谱法；柱前衍生化；2,4-二硝基氟苯；牛磺酸；鲍鱼
Precolumn Derivatization—Optimization on Determining Taurine by High
Performance Liquid Chromatogramphy
Huang Xiao-jie 1, Li Jing-hua 2，Wang Jun-de 2
1.Liaoning Medical university (jinzhou 121001；
2.Dalian Institute Of Chemical Physics (Dalian 116023)
Abstract Taurine was determined by reverse phase high performance liquid chromatographic method. Derivatized with 2,4-dinitro-fl uorobenzene, NaAc-Methanol(V:V=875:125) as mobile phase, with wavelength 360 nm. The external standard method was used. Get the best derivatized condition: 4.36 µmol taurine and 0.4% DNFB 0.1 mL, pH=7. This method was used for abalone, the content of taurine in abalone was 1.12 g/100 g. This method has better recovery and precision.
Keywords reversed-phase high performance liquid chromatography ；pre-column derivatization ；2,4-dinitro-fl uorobenzene ；taurine ；abalone
牛磺酸又称牛胆碱（taurine），化学名为2-氨基乙磺酸，是人体条件性必需氨基酸，以游离形式存在，不参与蛋白质代谢。

常见的牛磺酸检测方法有氨基酸分析仪法和高效液相色谱法[1]。

氨基酸分析仪法需要通过泵和反应器以保证洗脱液与柱后衍生试剂均匀混合，使仪器局限于一类分析。

柱前衍生反相高效液相色谱法常用的衍生剂有OPA和DNFB等。

OPA衍生法具有样品制备简单、衍生反应迅速等特点，但其衍生物不够稳定[2]；DNFB可以克服衍生物不稳定的缺点，但会产生衍生干扰物。

试验对高效液相色谱柱前DNFB衍生法的衍生条件进行优化，以克服衍生干扰物的影响，获得最优衍生条件。

1 实验部分
1.1 仪器和试剂
法国吉尔森GAD-LN007 型高效液相色谱仪、305型高压输液泵、Gilson715色谱软件、116型可编程序紫外吸收检测器。

色谱柱：本实验室自行研制的KF-AA05型反相氨基酸专用分析柱，(4.6×250) mm。

飞利浦搅拌机（型号HR 2860/60/A）。

牛磺酸标样：生化试剂，北京奥博星生物技术责任有限公司，纯度98%；衍生剂2,4-二硝基氟苯（DNFB）：德国Merck公司；离子对试剂N,N-二甲
基甲酰胺（N,N-DMF）：沈阳市联邦试剂厂，分析纯；乙腈为色谱纯(TEDIA)，鲍鱼样品为市售鲜样。

1.2 色谱条件
流动相：30 mM NaAc缓冲溶液-乙腈(体积比85∶15)，含1%N,N-二甲基甲酰胺，pH=6.20。

经0.45 µm滤膜过滤，超声脱气待用。

流速1.0 mL/min；检测波长360 nm；进样量10 µL。

1.3 溶液的配制
NaAc缓冲溶液：称取NaAc 2.46 g，加5 mL N,N-二甲基甲酰胺，重蒸馏水825 mL，乙腈175 mL，稀醋酸调pH至6.2。

标准溶液：称取牛磺酸标准品10.9 mg，置10 mL 量瓶中，加重蒸馏水至刻度，即得到1.09 mg/mL的标准溶液。

衍生缓冲溶液：配制不同p H 值的N a H C O 3和KH 2PO 4缓冲溶液（均为0.5 mol/L）。

衍生溶液：准确称取2,4-二硝基氟苯(0.2~1) g置于100 mL量瓶中，用乙腈稀释至刻度，得到0.2%~1%浓度的衍生溶液。

平衡溶液：配制0.1 mol/L pH=7.0的KH 2PO 4缓冲溶液。

1.4 牛磺酸标准的衍生化
准确吸取标准溶液0.1 mL，0.2 mL，0.4 mL，0.6
分析检测
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mL，0.8 mL，1.2 mL，2.4 mL，5.0 mL，10 mL，20 mL，30 mL于离心管中，50℃真空干燥箱烘干，加衍生缓冲溶液0.2 mL，1%衍生溶液0.1 mL，摇匀；避光，于60℃水浴保温1 h，立即加入平衡溶液0.7 mL，放置15 min后测定。

1.5 供试溶液的制备[3]
鲍鱼鲜样去壳用搅拌机搅碎，准确称取5 g已绞碎的待测样品，用0.1 mol/L磷酸盐缓冲液(pH=6.8)溶解样品，移入容量瓶中定容。

放入超声波振荡器中振荡15 min。

取1 mL经振荡的样液，5 000 r/min离心30 min，取上清液备用。

2 结果与讨论
2.1 衍生条件的选择2.1.1 pH值对衍生的影响
取20 µL牛磺酸标准溶液（0.17 µmol），50℃真空干燥箱烘干，加入pH为5，6，7，8，9，10，11的衍生缓冲溶液0.2 mL，0.2%的衍生溶液0.1 mL，于60℃水浴避光反应1 h，立即加入0.7 mL的平衡溶液，4℃贮存待用，进样量10 µL。

结果见图1，2。

从图中可看出，当pH值在7~9时，牛磺酸的峰面积达到最大，过酸或过碱时，峰面积降低。

随着pH值的增大，DNFB的水解产物DNP-OH的量也显著增加，pH>7时，副产物与牛磺酸的峰面积比值显著增大。

文献中[4]考察pH在9~11的范围内，确定最佳pH值为9，但此时DNP-OH的量过大，会影响牛磺酸和DNP-OH的分离度，如后期洗脱不彻底，会影响色谱柱的寿命，同时也增加了实验成本。

综合考虑，确定最佳pH为7，此时牛磺酸最大程度衍生且副产物的峰面积
图1 pH值对衍生的影响
图2 不同pH值时副产物与牛磺酸的面积比2.1.2 DNFB的浓度对衍生的影响
取500 µL牛磺酸标准溶液（4.36 µmol），50℃真空干燥箱烘干，加入pH为7的衍生缓冲溶液0.2
mL，不同浓度的衍生溶液0.1 mL，于60℃水浴避光反应1 h，立即加入0.7 mL的平衡溶液，4℃贮存待用，
进样量10 µL，结果见图3。

图3 DNFB对衍生的影响
从图3看出，当DNFB的浓度达到0.4%，再增加衍生剂的浓度，只会使DNFB的水解产物DNP-OH量成比例增加，牛磺酸的峰面积变化不大。

根据计算可知4 µg的DNFB和4.36 µg的牛磺酸即可充分反应。

2.1.3 衍生时间对衍生的影响
取20 µL牛磺酸标准溶液（0.17 µmol），50℃真空干燥箱烘干，加入pH=7的衍生缓冲溶液0.2 mL，1%的衍生溶液0.1 mL，于60℃水浴避光反应后，立即加入0.7 mL的平衡溶液，4℃贮存待用，进样量10 µL。

从图4中可以看出，衍生(30~90) min时效果较好，峰面积达到极值。

图5显示，副产物的峰面积随着衍生时间的增加而增大，90 min时的副产物峰面积比30 min高出近4倍，综合考虑，选择30 min即可，此时峰面积最大，牛磺酸与副产物的分离度最好，也可
以节省时间。

图4 不同衍生时间的影响
图5 不同衍生时间对副产物峰面积的影响2.2 标准曲线的绘制
取“1.4”节衍生化的样品分别进样10 µL，测得峰面积。

以峰面积Y对进样量X(µg)做线性回归，得到牛磺酸线性回归方程为Y=0.492 6 X+18.781(R 2=0.997 1),线性范围为(1~3270) µg(0.008 µmol ~26.16 µmol)，见图6。

计算可得，1 mg DNFB最多可以和26.16 µmol的牛磺酸发生充分的衍生反应。

2.3 样品测定
按“1.6”节方法处理3份鲍鱼样品后，各取20 µL上清液，50℃真空干燥箱烘干，加入pH为7的衍生缓冲溶液0.2 mL，1%的衍生溶液(以备充分反应)0.1
分析检测
70 利用量热法快速检测食品中细菌总数的方法研究
章海鹏，管骁，徐斐，华泽钊
上海理工大学医疗器械与食品学院 (上海 200093)
摘要提出一种可快速检测食品中细菌总数的新方法：利用菌体呼吸产生的CO
2
与菌体量的正比例关
系，通过对一段时间内CO
2
与碱液反应释放出的累计放热量的检测，实现对样品中初始菌量的快速测定。

在菌体培养过程中，选择搅拌转速为level2以及气体流速为4.0 mL/min作为培养条件，比较不同初始菌量的累积放热量，成功建立了一条“热量值-细菌总数”的标准曲线，证明这种方法是可行的。

关键字量热法；CO
2
；细菌总数；快速检测
Studies on the Rapid Detection Method of the Total Bacterial Count in Food by
Calorimetry
Zhang Hai-peng，Guan Xiao，Xu Fei，Hua Ze-chao
Institute of Medical Instrument and Food Engineering, University of Shanghai for Science and Technology
（Shanghai 200093）
Abstract This paper put forward a rapid method detecting total bacterial count in food. The CO2 produced by bacterial have the positive proportion to the total bacterial count. Therefore, the original total bacterial count can
be calculated by detecting the total react heat quantity between CO
2
and alkali using DSC. In this experiment the rotate speed on level 2 and the fl ow velocity on 4.0mL/min as the cultivate condition were chosed, and a “caloricity- total bacterial count”curve was established. The results showed that the method was reasonable.
Keywords calorimetry；CO2；total bacterial count；
rapid detection
图6 牛磺酸标准曲线
mL，于60℃水浴避光反应1 h，立即加入0.7 mL的平
衡溶液，4℃贮存待用，进样量10 µL。

对样品进行6
次试验，结果见表1。

由表1可以看出，两次平行间的
相对偏差都在5%以内。

表1 鲍鱼中牛磺酸测定结果
序号含量/g/100 g
1 1.06
0.96
2 1.05
1.00
31.32 1.34
2.4 加标回收率试验
按“1.6”节方法处理样品后，取20 µL上清液和20 µL牛磺酸标准溶液，50℃真空干燥箱烘干，加入pH为7的衍生缓冲溶液0.2 mL，1%的衍生溶液0.1 mL，于60℃水浴避光反应1 h，立即加入0.7 mL的平衡溶液，4℃贮存待用，进样量10 µL。

加标回收率的测定结果见表2。

表2 鲍鱼样品中牛磺酸的加标回收率
加标量/mg基础量/mg回收率/%平均回收率/%RSD/%
0.02180.016274.3
0.02180.018886.284.0710.5
0.02180.0291.7
3 结论
3.1 经试验确定最佳衍生条件：
4.36 µmol的牛磺酸，加入0.4% DNFB 0.1 mL在pH=7时衍生30 min最佳。

3.2 方法标准曲线线性好，回归方程为Y=0.492 6 X +18.781(R2=0.997 1)，线性范围为(1~327 0) µg（0.008 µmol~26.16 µmol）。

3.3 此方法回收率与精密度试验结果较好，两次平行间的相对偏差都在5%以内，回收率RSD为10.5%。

参考文献：
[1] Zhang Zhiguo，Liu Ning，JiaYunhong，Xie Yan，Li Qi. Food and Fermentation Industries，2004，
[2] Yu Hong，Mu Shifen.Chinese Journal of Analytical Chemistry，2005，33：398.
[3] Tan Leyi，Xue Changhu，Lin Hong，Li Zhaojie. Marine Sciences，2001，1：26.
[4] Liu Hongzhou，You Ruichen. Subtrop.Plant Res. Commun.，1999，28（1）：47.
分析检测。