常温纤维素降解菌的分离与鉴定
合集下载
相关主题
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ Ｔｏ ｉｓｏｌａｔｅ ａｎｄ ｃｕｌｔｕｒｅ ｔｈｅ ｂａｃｔｅｒｉａ ｔｈａｔ ｃａｎ ｄｅｇｒａｄｅ ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ ｕｎｄｅｒ ｒｏｏｍ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ· Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｓａｍｐｌｅｓ ｏｆ ｄｅｃａｙｅｄ ｌｅａｖｅｓ（ｎ＝６），ｓｕｒｆａｃｅ ｓｏｉｌ（ｎ＝６）ａｎｄ ｐｏｌｌｕｔｅｄ ｗａｔｅｒ（ｎ＝２）ｗｅｒｅ ｃｏｌｌｅｃｔｅｄ，ａｎｄ ｗｅｒｅ ｓｅｅｄｅｄ ｉｎｔｏ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｆｉｂｅｒ ｍｅｄｉａ．Ｃｏｍｐｏｕｎｄ ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ ｍｅｄｉａ ｗｅｒｅ ｕｓｅｄ ｆｏｒ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ，ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｌ ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ ｓｏｄｉｕｍ（ＣＭＣ—Ｎａ）ｐｌａｔｅｓ ｗｅｒｅ ｅｍｐｌｏｙｅｄ ｆｏｒ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ，ｅｎｒｉｃｈｅｄ ｍｅｄｉａ ｗｅｒｅ ａｄｏｐｔｅｄ ｆｏｒ ｃｕｌｔｕｒｅ，ａｎｄ ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ－ｄｅｇｒａｄｉｎｇ ｂａｃｔｅｒｉａ ｗｅｒｅ ｏｂｔａｉｎｅｄ ａｆｔｅｒ ｃｅｌｌｕｌａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｕｎｄｅｒ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｏｆ ２２℃．Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ｗａｓ ｅｘｔｒａｃｔｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅｓｅ ｂａｃｔｅｒｉａ．ａｎｄ ｗａｓ ｓｅｑｕｅｎｃｅｄ ｗｉｔｈ ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ｐｒｉｍｅｒｓ ｆｏｒ １６Ｓ ｒＤＮＡ．Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｗｅｒｅ ａｌｉｇｎｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｄａｔａ ｏｆ Ｇｅｎｅｂａｎｋ ｔｏ ｉｄｅｎｔｉｆｙ ｔｈｅ ｔａｒｇｅｔ ｂａｃｔｅｒｉａ． Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｔｈｒｅｅ ｓｔｒａｉｎｓ ｏｆ ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ—ｄｅｇｒａｄｉｎｇ ｂａｃｔｅｒｉａ ｗｅｒｅ ｉｓｏｌａｔｅｄ，ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｅｅｌｌｕｌａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ０．０２８ ｐｇ／ｍｉｎ， ０．５７斗ｇ／ｒａｉｎ ａｎｄ １．２斗ｇ／ｒａｉｎ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ａｎａｌｙｓｉｓ ｒｅｖｅａｌｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｍａｔｃｈｉｎｇ ｒａｔｅｓ ｂｅｔｗｅｅｎ ｔｈｅｓｅ ３ ｓｔｒａｉｎｓ ｏｆ ｂａｃｔｅｒｉａ ａｎｄ Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ，Ｃａｎｄｉｄａｔｇｓ Ｃｈｒｙｓｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍａｓｓｉｌｉａｅ ａｎｄ Ｃｈｒｙｓｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｗｅｒｅ ９９％，９７％ａｎｄ ９７％， ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ． Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ—ｄｅｇｒａｄｉｎｇ ｂａｃｔｅｒｉａ ｃａｎ ｂｅ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｄｅｃａｙｅｄ ｌｅａｖｅｓ，ｓｕｒｆａｃｅ ｓｏｉｌ ａｎｄ ｐｏｌｌｕｔｅｄ ｗａｔｅｒ ｂｏｄｉｅｓ ｕｎｄｅｒ ｒｏｏｍ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ·ｄｅｇｒａｄｉｎｇ ｂａｃｔｅｒｉａ；ｉｓｏｌａｔｉｏｎ；ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ；ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ
摘要：目的分离培养常温下能降解纤维素的细菌。方珐采集腐烂植物样本６份、表层土壤样本６份和污染水体样本２份；
在２２℃条件下，采用复合纤维素培养基筛选，羧甲基纤维素钠刚果红平板分离，富集培养基扩增培养；重复多次操作，测定纤维
素酶活性后获得常温下具有纤维素酶活性的菌株；提取细菌基因组ＤＮＡ，对１６Ｓ ｒＤＮＡ进行测序，并与Ｇｅｎｅｂａｎｋ对比，鉴定其种
纤维素是构成植物细胞壁的主要成分，也是地 球上最丰富的可再生资源。纤维素的降解需要外切 葡聚糖酶、内切葡聚糖酶等多种酶的共同作用才能 完成。部分细菌和真菌具有纤维素酶活性，但需要 较高的工作温度，因此，人类对纤维素的利用十分有 限…。本研究拟在室温下分离具有纤维素酶活性的 细菌，为提高纤维素的利用度，为污染环境的生态修 复提供较为有效的菌株。
·１０１８·
上海交通大学学报（医学版） Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｊｉａｏｔｏｎｇ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ）
文章编号：１６７４－８１１５（２０１０）０８—１０１８—０４
Ｖ０１．３０ Ｎｏ．８ Ａｕｇ．２０１０
·技术与方法·
常温纤维素降解茵的分离与鉴定
陈燕， 周孙全。 郑奇士， 周义军，王艳， 谭佑铭 （上海交通大学公共卫生学院，上海２０００２５）
属。结罩分离出３株常温下具有纤维素酶活性的细菌，其纤维索酶活性分别为０．０２８、０．５７和１．２斗ｇ／ｍｉｎ。经鉴定，３株细菌
与类芽孢杆菌属、暂定种金黄色杆菌和金黄杆菌的匹配度分别为９９％、９７％和９７％。结论从腐烂的树叶、腐烂树叶下的表层土
壤和污染水体中均能分离出常温下具有纤维素酶活性的菌株。
关键词：纤维素降解菌；分离；筛选；纤维素
０．８，ＭｇＳ０４·７Ｈ２０ Ｏ．５，ＣａＣｌ２ ０．５，ＦｅＳ０４·７Ｈ２０ ０．０１，
ＭｎＳ０４·Ｈ２０ ０．０１，ＺｎＳ０４ ０．０１，ＣＭＣ．Ｎａ １０．０，蛋白胨 Ｉ．０，酵母膏１．０，ｐＨ值７．０—７．２。 １．３试剂和仪器
所用试剂均为市售分析纯或生化试剂。仪器： Ｔ６Ｓ型紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限 责任公司）、ＤＫ一８Ｄ型电热恒温水槽（上海一恒科 技有限公司）、ＤＨＰ一９１６２电热恒温培养箱（上海一 恒科学仪器公司）、ＺＨＷＹ一２００Ｂ型恒温培养振荡器 （上海智城分析仪器制造有限公司）、ＰＢ一１０型酸度 计（Ｓａｒｔｏｆｉｕｓ）、ＳＰＮ２０２Ｆ型电子天平［梅特勒一托利 多（常州）称重设备系统有限公司］、５８１０Ｒ型离心机 （Ｅｐｐｅｎｄｏｆｆ）、佳能ＳＸ２００型数码相机。 １．４实验方法 １．４．１筛选取２０ ｇ或２０ ｍＬ样品接种至复合纤 维素筛选培养基，在２２℃恒温静置培养。每１３观察 并振摇１次，至培养基浑浊。取１０ ｍＬ菌液接种于 新鲜的筛选培养基中培养１周，重复操作数次。 １．４．２分离和富集培养 从筛选培养基中取菌液 在分离培养基上划线，每次划线均作平行操作。平 皿置２２℃培养５ ｄ后，其中一皿用１ ｍｏｌ／Ｌ的氯化 钠溶液脱色处理４０ ｒａｉｎ。脱色处理前后均用数码相 机拍照，观察平皿上是否出现水解环以及水锯环的
作者简介：陈燕（１９８８一），女．本科生；电子信箱：ｃｈｅｎｙａｎ·ｔｃｅｌ４＠ｑｑ．ｃｏｍｏ 通讯作者：谭佑铭，电子信葙：ｗｅｒｔｈｅｒ＿ｔａｎ＠ｙａｈｏｏ．ｏｏｌｎ．ｃｎｏ
万方数据
陈燕，等：常温纤维素降解菌的分离与鉴定
即带回实验室接种。 １．２培养基 １．２．１ 筛选培养基 培养基的配制基本参照文献 ［２－３］进行（ｇ／Ｌ）：Ｎａ：ＨＰＯ。３．０，ＮＨ。ＮＯ，０．８，ＭｇＳＯ。· ７Ｈ２０ ０．１，ＣａＣｌ２ ０．１，羧甲基纤维素钠（ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｌ ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ ｓｏｄｉｕｍ，ＣＭＣ—Ｎａ）２．０，微晶纤维素粉１．０，滤 纸２．０，稻草２。０，ｐＨ值７．０—７．２。其中滤纸和稻草 在使用前需作处理，预处理方法如下：滤纸用１％醋 酸浸泡过夜，若无淀粉残留，用蒸馏水反复浸泡，洗 至中性，烘干后备用；将稻草洗净，去除残余的谷粒 后，剪成长度约为３ ｃａ的小片段，置蒸馏水中煮沸 １０ ｒａｉｎ，蒸馏水漂洗３次后烘干备用。 １．２．２分离培养基ＣＭＣ—Ｎａ刚果红培养基（ｇ／Ｌ）： Ｋ２ＨＰＯ。０．５，ＭｇＳ０４ Ｏ．２５，ＣＭＣ·Ｎａ ２，刚果红０．２，蛋 白胨２，酵母膏１，琼脂１５，水１ Ｌ，自然ｐＨ值。 １．２．３富集培养基（ｇ／Ｌ）ＫＨＰＯ。０．５，ＭｇＳＯ。０．２５， ＣＭＣ—Ｎａ ２，蛋白胨２，酵母膏２，水１ Ｌ，自然ｐＨ值。 １．２．４产酶培养基（∥Ｌ） Ｎａ：ＨＰＯ。３．０，ＮＨ。Ｎ０３
１材料与方法
１．１环境样品 于２００９年１０月２日（雨后第２天）在上海植物
园采集腐烂的树叶、竹根和野草；从腐烂的植物下采 集表层湿润、肥沃的土壤；从被污染且长有大量水生 植物的景观水体中采集水样。共采得１４份样品，其 中水样２份，植物和土壤样品各６份。采集样品后立
基金项目：上海交通大学医学院自然基金（２００７ｘＪ００７）；上海市教委创新项目（ｏｇｚｚｌｌｌ）；上海市科委自然基金（０９ＺＲｌ４１５５００）；大学生创新项目 （０９１０２４８５９）（Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｈａｎｓｈａｉ Ｊｉａｏｔｏｎｇ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，２００７Ｙ，Ｊ００７）；Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，０９ＺＺｌｌｌ； ＳｈａｈＩｇｈａｉ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，０９ＺＲｌ４１５５００；Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ Ｐｒｏｇｒａｍ ｆｏｒ Ｕｎｄｅｒｇｒａｄｕａｔｅｅ，０９１０２４８５９）ｏ
２结 果百度文库
２．１滤纸降解情况 经数次驯化培养和划线分离后，获得具有纤维
素酶活性的菌株３株（图１），对滤纸均有一定的降解 能力；其中菌株１对滤纸的降解特点为滤纸逐渐变
万方数据
’１０２０’
上海交通大学学报（医学版）
薄并消解，而菌株２和菌株３对滤纸的降解情况则为 滤纸先肿胀发泡，然后逐渐崩解。 ２．２菌落形态及水解环
ＤｏＩ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１６７４．８１ １５．２０１０．０８．０３６
中图分类号：Ｓ１８８
文献标志码：Ｂ
Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ－ｄｅｇｒａｄｉｎｇ ｂａｃｔｅｒｉａ ｕｎｄｅｒ ｒｏｏｍ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ
ＣＨＥＮ Ｙａｎ，ＺＨＯＵ Ｓｕｎ—ｑｕａｎ，ＺＨＥＮＧ Ｑｉ－ｓｈｉ，ＺＨＯＵ Ｙｉ－ｊｕｎ，ＷＡＮＧ Ｙａｎ，ＴＡＮ Ｙｏｕ－ｍｉｎｇ （Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ，Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｊｉａｏｔｏｎｇ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｓｈａｎｇｈａｉ ２０００２５，Ｃｈｉｎａ）
大小。取水解环清晰且大的菌株点种至分离平板， 每株菌点种４处，计算各菌落与水解环直径比值的 均值。同时，参考水解环产生的先后和清晰度，初步 比较不同菌株的纤维素酶活性，并确定用于酶活性 测定的菌株。将分离得到的优势菌株接种至富集培 养基或产酶培养基，可用于纤维素酶活性的测定及 其他实验。 １．４．３纤维素酶活性测定 纤维素酶活性的测定 采用３，５一二硝基水杨酸（３，５－ｄｉｎｉｔｒｏｓａｌｉｃｙｌｉｃ ａｃｉｄ， ＤＮＳ）法，主要测定步骤参照文献［４］进行。取５ ｍＬ 菌液，接种于４５ ｍＬ产酶培养基中，２２℃培养５ ｄ后 取１０ ｍＬ菌液，４ ０００ ｒ／ｒａｉｎ离心１５ ｒａｉｎ后取上清液， 测定其中还原糖的含量，根据还原糖的产量确定纤 维素酶的活力。酶活定义为：在ｐＨ ５．０和５０℃条件 下，每１ ｍＬ纤维素初酶液在１ ｒａｉｎ内水解ＣＭＣ—Ｎａ， 生成１斗ｇ的葡萄糖，称为一个ＣＭＣ酶活力单位 （斗ｇ／ｍｉｎ）。 １．４．４葡萄糖标准曲线的绘制 准确称取１００ ｍｇ 分析纯的无水葡萄糖，用少量蒸馏水溶解后定量转移 到１００ ｍＬ容量瓶中，再定容，摇匀，浓度为１ ｍｓ／ｍＬ。 取６支比色管，分别加入０．０、０．１０、０．２０、０．３０、０．４０ 和０．５ ｍＬ葡萄糖标准溶液，用蒸馏水稀释至 ５．０ ｍＬ，各管加入ＤＮＳ溶液５．０ ｍＬ，沸水浴５ ｒａｉｎ， 冷却后定容至２５ ｍＬ，５４０ ｎｍ波长处用空白管溶液 调零后测定各管吸光度值，并绘制葡萄糖标准曲线。 １．４．５ 菌种鉴定 用沸水浴法提取细菌基因组 ＤＮＡ。将细菌菌液置于１．５ ｍＬ的离心管中，１００℃ 水浴煮沸１０ ｍｉｎ，然后１２ ０００×ｇ离心５ ｍｉｎ。用上 清作ＤＮＡ模板，一２０℃保存备用。用菌种鉴定通用 引物对１６Ｓ ｒＤＮＡ片段进行ＰＣＲ扩增【５ Ｊ，引物序列如 下。上游引物：ＡＧＡＧｌｌ陌ＧＡＴＣＣＴＧＧＣＴＣＡＧ；下游 弓ｌ物： ＡＣＧＧＣＴＡＣＣＴＴＧＴＴＡＣＧＡＣＴＴ。ＰＣＲ条件： ９５℃预变性５ ｒａｉｎ；９４℃变性６０ ｓ，６０℃退火６０ ｓ， ７２℃延伸９０ ｓ，３０个循环；７２℃终延伸１０ ｒａｉｎ。将 结果与Ｇｅｎｅｂａｎｋ对比，鉴定其种属。
摘要：目的分离培养常温下能降解纤维素的细菌。方珐采集腐烂植物样本６份、表层土壤样本６份和污染水体样本２份；
在２２℃条件下，采用复合纤维素培养基筛选，羧甲基纤维素钠刚果红平板分离，富集培养基扩增培养；重复多次操作，测定纤维
素酶活性后获得常温下具有纤维素酶活性的菌株；提取细菌基因组ＤＮＡ，对１６Ｓ ｒＤＮＡ进行测序，并与Ｇｅｎｅｂａｎｋ对比，鉴定其种
纤维素是构成植物细胞壁的主要成分，也是地 球上最丰富的可再生资源。纤维素的降解需要外切 葡聚糖酶、内切葡聚糖酶等多种酶的共同作用才能 完成。部分细菌和真菌具有纤维素酶活性，但需要 较高的工作温度，因此，人类对纤维素的利用十分有 限…。本研究拟在室温下分离具有纤维素酶活性的 细菌，为提高纤维素的利用度，为污染环境的生态修 复提供较为有效的菌株。
·１０１８·
上海交通大学学报（医学版） Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｊｉａｏｔｏｎｇ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ）
文章编号：１６７４－８１１５（２０１０）０８—１０１８—０４
Ｖ０１．３０ Ｎｏ．８ Ａｕｇ．２０１０
·技术与方法·
常温纤维素降解茵的分离与鉴定
陈燕， 周孙全。 郑奇士， 周义军，王艳， 谭佑铭 （上海交通大学公共卫生学院，上海２０００２５）
属。结罩分离出３株常温下具有纤维素酶活性的细菌，其纤维索酶活性分别为０．０２８、０．５７和１．２斗ｇ／ｍｉｎ。经鉴定，３株细菌
与类芽孢杆菌属、暂定种金黄色杆菌和金黄杆菌的匹配度分别为９９％、９７％和９７％。结论从腐烂的树叶、腐烂树叶下的表层土
壤和污染水体中均能分离出常温下具有纤维素酶活性的菌株。
关键词：纤维素降解菌；分离；筛选；纤维素
０．８，ＭｇＳ０４·７Ｈ２０ Ｏ．５，ＣａＣｌ２ ０．５，ＦｅＳ０４·７Ｈ２０ ０．０１，
ＭｎＳ０４·Ｈ２０ ０．０１，ＺｎＳ０４ ０．０１，ＣＭＣ．Ｎａ １０．０，蛋白胨 Ｉ．０，酵母膏１．０，ｐＨ值７．０—７．２。 １．３试剂和仪器
所用试剂均为市售分析纯或生化试剂。仪器： Ｔ６Ｓ型紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限 责任公司）、ＤＫ一８Ｄ型电热恒温水槽（上海一恒科 技有限公司）、ＤＨＰ一９１６２电热恒温培养箱（上海一 恒科学仪器公司）、ＺＨＷＹ一２００Ｂ型恒温培养振荡器 （上海智城分析仪器制造有限公司）、ＰＢ一１０型酸度 计（Ｓａｒｔｏｆｉｕｓ）、ＳＰＮ２０２Ｆ型电子天平［梅特勒一托利 多（常州）称重设备系统有限公司］、５８１０Ｒ型离心机 （Ｅｐｐｅｎｄｏｆｆ）、佳能ＳＸ２００型数码相机。 １．４实验方法 １．４．１筛选取２０ ｇ或２０ ｍＬ样品接种至复合纤 维素筛选培养基，在２２℃恒温静置培养。每１３观察 并振摇１次，至培养基浑浊。取１０ ｍＬ菌液接种于 新鲜的筛选培养基中培养１周，重复操作数次。 １．４．２分离和富集培养 从筛选培养基中取菌液 在分离培养基上划线，每次划线均作平行操作。平 皿置２２℃培养５ ｄ后，其中一皿用１ ｍｏｌ／Ｌ的氯化 钠溶液脱色处理４０ ｒａｉｎ。脱色处理前后均用数码相 机拍照，观察平皿上是否出现水解环以及水锯环的
作者简介：陈燕（１９８８一），女．本科生；电子信箱：ｃｈｅｎｙａｎ·ｔｃｅｌ４＠ｑｑ．ｃｏｍｏ 通讯作者：谭佑铭，电子信葙：ｗｅｒｔｈｅｒ＿ｔａｎ＠ｙａｈｏｏ．ｏｏｌｎ．ｃｎｏ
万方数据
陈燕，等：常温纤维素降解菌的分离与鉴定
即带回实验室接种。 １．２培养基 １．２．１ 筛选培养基 培养基的配制基本参照文献 ［２－３］进行（ｇ／Ｌ）：Ｎａ：ＨＰＯ。３．０，ＮＨ。ＮＯ，０．８，ＭｇＳＯ。· ７Ｈ２０ ０．１，ＣａＣｌ２ ０．１，羧甲基纤维素钠（ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｌ ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ ｓｏｄｉｕｍ，ＣＭＣ—Ｎａ）２．０，微晶纤维素粉１．０，滤 纸２．０，稻草２。０，ｐＨ值７．０—７．２。其中滤纸和稻草 在使用前需作处理，预处理方法如下：滤纸用１％醋 酸浸泡过夜，若无淀粉残留，用蒸馏水反复浸泡，洗 至中性，烘干后备用；将稻草洗净，去除残余的谷粒 后，剪成长度约为３ ｃａ的小片段，置蒸馏水中煮沸 １０ ｒａｉｎ，蒸馏水漂洗３次后烘干备用。 １．２．２分离培养基ＣＭＣ—Ｎａ刚果红培养基（ｇ／Ｌ）： Ｋ２ＨＰＯ。０．５，ＭｇＳ０４ Ｏ．２５，ＣＭＣ·Ｎａ ２，刚果红０．２，蛋 白胨２，酵母膏１，琼脂１５，水１ Ｌ，自然ｐＨ值。 １．２．３富集培养基（ｇ／Ｌ）ＫＨＰＯ。０．５，ＭｇＳＯ。０．２５， ＣＭＣ—Ｎａ ２，蛋白胨２，酵母膏２，水１ Ｌ，自然ｐＨ值。 １．２．４产酶培养基（∥Ｌ） Ｎａ：ＨＰＯ。３．０，ＮＨ。Ｎ０３
１材料与方法
１．１环境样品 于２００９年１０月２日（雨后第２天）在上海植物
园采集腐烂的树叶、竹根和野草；从腐烂的植物下采 集表层湿润、肥沃的土壤；从被污染且长有大量水生 植物的景观水体中采集水样。共采得１４份样品，其 中水样２份，植物和土壤样品各６份。采集样品后立
基金项目：上海交通大学医学院自然基金（２００７ｘＪ００７）；上海市教委创新项目（ｏｇｚｚｌｌｌ）；上海市科委自然基金（０９ＺＲｌ４１５５００）；大学生创新项目 （０９１０２４８５９）（Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｈａｎｓｈａｉ Ｊｉａｏｔｏｎｇ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，２００７Ｙ，Ｊ００７）；Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，０９ＺＺｌｌｌ； ＳｈａｈＩｇｈａｉ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，０９ＺＲｌ４１５５００；Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ Ｐｒｏｇｒａｍ ｆｏｒ Ｕｎｄｅｒｇｒａｄｕａｔｅｅ，０９１０２４８５９）ｏ
２结 果百度文库
２．１滤纸降解情况 经数次驯化培养和划线分离后，获得具有纤维
素酶活性的菌株３株（图１），对滤纸均有一定的降解 能力；其中菌株１对滤纸的降解特点为滤纸逐渐变
万方数据
’１０２０’
上海交通大学学报（医学版）
薄并消解，而菌株２和菌株３对滤纸的降解情况则为 滤纸先肿胀发泡，然后逐渐崩解。 ２．２菌落形态及水解环
ＤｏＩ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１６７４．８１ １５．２０１０．０８．０３６
中图分类号：Ｓ１８８
文献标志码：Ｂ
Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ－ｄｅｇｒａｄｉｎｇ ｂａｃｔｅｒｉａ ｕｎｄｅｒ ｒｏｏｍ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ
ＣＨＥＮ Ｙａｎ，ＺＨＯＵ Ｓｕｎ—ｑｕａｎ，ＺＨＥＮＧ Ｑｉ－ｓｈｉ，ＺＨＯＵ Ｙｉ－ｊｕｎ，ＷＡＮＧ Ｙａｎ，ＴＡＮ Ｙｏｕ－ｍｉｎｇ （Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ，Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｊｉａｏｔｏｎｇ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｓｈａｎｇｈａｉ ２０００２５，Ｃｈｉｎａ）
大小。取水解环清晰且大的菌株点种至分离平板， 每株菌点种４处，计算各菌落与水解环直径比值的 均值。同时，参考水解环产生的先后和清晰度，初步 比较不同菌株的纤维素酶活性，并确定用于酶活性 测定的菌株。将分离得到的优势菌株接种至富集培 养基或产酶培养基，可用于纤维素酶活性的测定及 其他实验。 １．４．３纤维素酶活性测定 纤维素酶活性的测定 采用３，５一二硝基水杨酸（３，５－ｄｉｎｉｔｒｏｓａｌｉｃｙｌｉｃ ａｃｉｄ， ＤＮＳ）法，主要测定步骤参照文献［４］进行。取５ ｍＬ 菌液，接种于４５ ｍＬ产酶培养基中，２２℃培养５ ｄ后 取１０ ｍＬ菌液，４ ０００ ｒ／ｒａｉｎ离心１５ ｒａｉｎ后取上清液， 测定其中还原糖的含量，根据还原糖的产量确定纤 维素酶的活力。酶活定义为：在ｐＨ ５．０和５０℃条件 下，每１ ｍＬ纤维素初酶液在１ ｒａｉｎ内水解ＣＭＣ—Ｎａ， 生成１斗ｇ的葡萄糖，称为一个ＣＭＣ酶活力单位 （斗ｇ／ｍｉｎ）。 １．４．４葡萄糖标准曲线的绘制 准确称取１００ ｍｇ 分析纯的无水葡萄糖，用少量蒸馏水溶解后定量转移 到１００ ｍＬ容量瓶中，再定容，摇匀，浓度为１ ｍｓ／ｍＬ。 取６支比色管，分别加入０．０、０．１０、０．２０、０．３０、０．４０ 和０．５ ｍＬ葡萄糖标准溶液，用蒸馏水稀释至 ５．０ ｍＬ，各管加入ＤＮＳ溶液５．０ ｍＬ，沸水浴５ ｒａｉｎ， 冷却后定容至２５ ｍＬ，５４０ ｎｍ波长处用空白管溶液 调零后测定各管吸光度值，并绘制葡萄糖标准曲线。 １．４．５ 菌种鉴定 用沸水浴法提取细菌基因组 ＤＮＡ。将细菌菌液置于１．５ ｍＬ的离心管中，１００℃ 水浴煮沸１０ ｍｉｎ，然后１２ ０００×ｇ离心５ ｍｉｎ。用上 清作ＤＮＡ模板，一２０℃保存备用。用菌种鉴定通用 引物对１６Ｓ ｒＤＮＡ片段进行ＰＣＲ扩增【５ Ｊ，引物序列如 下。上游引物：ＡＧＡＧｌｌ陌ＧＡＴＣＣＴＧＧＣＴＣＡＧ；下游 弓ｌ物： ＡＣＧＧＣＴＡＣＣＴＴＧＴＴＡＣＧＡＣＴＴ。ＰＣＲ条件： ９５℃预变性５ ｒａｉｎ；９４℃变性６０ ｓ，６０℃退火６０ ｓ， ７２℃延伸９０ ｓ，３０个循环；７２℃终延伸１０ ｒａｉｎ。将 结果与Ｇｅｎｅｂａｎｋ对比，鉴定其种属。