蜂蜜中β-呋喃果糖苷酶实验设计

蜂蜜中β-呋喃果糖苷酶实验设计

──3,5－二硝基水杨酸法

目的要求：

通过测定还原糖的量，蜂蜜中β-呋喃果糖苷酶对庶糖的效率以及已知β-呋喃果糖苷酶的量，得出未知β-呋喃果糖苷酶的量。

实验原理:

在NaOH和丙三醇存在下，3,5－二硝基水杨酸（DNS）与还原糖共热后被还原生成氨基化合物。在过量的NaOH碱性溶液中此化合物呈桔红色，在540nm波长处有最大吸收，在一定的浓度范围内，还原糖的量与光吸收值呈线性关系，利用比色法可测定样品中的含糖量。

试剂和器材

一、试剂

3,5－二硝基水杨酸（DNS）试剂：称取6.5g DNS溶于少量热蒸馏水中，溶解后移入1000ml容量瓶中，加入2mol/L氢氧化钠溶液325ml，再加入45g丙三醇，摇匀，冷却后定容至1000ml。

葡萄糖标准溶液：准确称取干燥恒重的葡萄糖200mg，加少量蒸馏水溶解后，以蒸馏水定容至100ml，即含葡萄糖为2.0mg/ml。

6mol/L HCl：取250ml浓HCl（35%～38%）用蒸馏水稀释到500ml。

碘－碘化钾溶液：称取5g碘，10g碘化钾溶于100ml蒸馏水中。

6N NaOH：称取120g NaOH溶于500ml蒸馏水中。

0.1% 酚酞指示剂。

二、材料

藕粉，玉米淀粉。

三、器材

WFJ UV－2000型分光光度计，水浴锅，电炉，15mm×180mm试管。

操作方法

一、葡萄糖标准曲线制作

取5支15mm×180mm试管，按下表加入2.0mg/ml葡萄糖标准液和蒸馏水。

在上述试管中分别加入DNS试剂2.0ml，于沸水浴中加热2min进行显色，取出后用流动水迅速冷却，各加入蒸馏水9.0ml，摇匀，在540nm波长处测定光吸收值。以1.0ml蒸馏水代替葡萄糖标准液按同样显色操作为空白调零点。以葡萄糖含量（mg）为横坐标，光吸收值为纵坐标，绘制标准曲线。

二、样品中还原糖的提取

准确称取0.5g藕粉，放在100ml烧杯中，先以少量蒸馏水(约2 ml)调成糊状，然后加入40ml蒸馏水，混匀，于50℃黄色桔红色恒温水浴中保温20min，不时搅拌，使还原糖浸出混。过滤，将滤液全部收集在50ml的容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，即为还原糖提取液。

三、样品总糖的水解及提取

准确称取0.5g玉米淀粉，放在锥形瓶中，加入6mol/L HCl 10ml，蒸馏水15ml，在沸水浴中加热0.5h，取出1～2滴置于白瓷板上，加1滴I-KI溶液检查水解是否完全。如已水解完全，则不呈现蓝色。水解毕，冷却至室温后加入1滴酚酞指示剂，以6N NaOH溶液中和至溶液呈微红色，并定容到100ml，过滤取滤液10ml于100ml容量瓶中，定容至刻度，混匀，即为稀释1000倍的总糖水解液，用于总糖测定。

四、样品中含糖量的测定

取7支15mm×180mm试管，分别按下表加入试剂：

加完试剂后，于沸水浴中加热2min进行显色，取出后用流动水迅速冷却，各加入蒸馏水9.0ml，摇匀，在540nm波长处测定光吸收值。测定后，取样品的光吸收平均值在标准曲线上查出相应的糖量。

五、结果处理

按下式计算出样品中还原糖和总糖的百分含量：

式中：C──还原糖或总糖提取液的浓度，mg/ml；

V──还原糖或总糖提取液的总体积，ml；

m──样品重量g；

1000──mg换算成g的系数。

注意事项

标准曲线制作与样品含糖量测定应同时进行，一起显色和比色

1.1.2 马铃薯提取液的制备

准确称取马铃薯样品粉末（称前烘干至恒重）

1 g 左右放入50 mL 容量瓶中，其它步骤见文献[3]。

1.1.3 仪器

山东752 型紫外光栅分光光度计。

1.1.4 试剂

1 mg•mL- 1 葡萄糖标准液：准确称取1 g 的无水葡萄糖，待溶解后定容至1000 mL。DNS 显色液：准确称取无水的3,5- 二硝基水杨酸6.5 g 溶解待用。无水氢氧化钠40 g 溶解后移入500 mL 容量瓶，冷却后定容。将水杨酸溶解液移入1000 mL 容量瓶并加入325 mL 的氢氧化钠，再加入15 mL 丙三醇溶解定容至1 000 mL 贮存于棕色试剂瓶中。以上试剂均为分析纯。水为蒸馏水。

1.2 试验方法

1.2.1 吸收光谱的测定

准确吸取3、5、7 mL 的DNS 于50 mL 容量瓶中并定容。取1、3、5、7 mL 葡萄糖标准液

于50 mL 容量瓶中并加入5 mL DNS，加水至25mL 左右。在沸水浴中煮5 min，流水迅速冷却，定容摇匀，20 min 后在400～560 nm 之间测吸光值。

1.2.2 标准曲线的测定

准确取1、2、3、4、5、6、7、8 mL 的葡萄糖标准液分别加入到50 mL 的容量瓶中，各加5mL 的DNS 在沸水浴中煮5 min 后流水迅速冷却，定容摇匀，空白调零。20 min 后在所确定的吸收光谱波长下测定吸光值。

1.2.3 显色剂用量的选择

为了保证显色完全，我们采用高浓度葡萄糖的标准液来进行DNS 用量的选择。准确吸取4 mL 的

葡萄糖标准液加入50 mL 容量瓶中，并分别加入3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7 mL DNS 于容量瓶中加水约25 mL，步骤同上。

1.2.4 显色时间的确定

准确吸取1、2、4 mL 葡萄糖标准液分别加入到50 mL 的容量瓶中，各加5 mL DNS，并在沸水

浴中煮2、3、4、5、6、7、8、10、12、14、16、18、20 min，步骤同上。

1.2.5 稳定时间的确定

任意选择一个马铃薯样品提取液，准确吸取葡萄糖标准液2 mL 和样品提取液4 mL 加入容量瓶，步骤同上。显色后放置20 min、1、2、3、4、5、6 h 后测定吸光值。

1.2.6 马铃薯样品DNS 显色吸光度曲线

任意选取5 个还原糖含量不同的马铃薯提取液（稀释倍数12.5）进行重复扫描，获得吸光值。

1.2.7 不同波长下马铃薯还原糖含量的比较任意选取12 个还原糖含量不同的马铃薯样品

提取液，在本文所确定的波长和相关文献报道的波长（540 nm）下进行扫描，根据所获得的吸光值，在不同波长下的标准曲线中分别查出相对应的浓度，并计算总糖含量[4]。

1.2.8 数据处理

试验数据用EXCEL2000 进行处理和作图，并采用成对数据比较和t 测验法进行差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 吸收光谱

波长在400～600 nm范围内对DNS 液以及葡萄糖标准液反应生成的氨化合物（蒸馏水调零）的吸收光谱进行了扫描，由于所使用的分光光度计灵敏度低，DNS 用量大等原因，图1 未能测得400～480nm 的吸光值，图2 未得到510 nm 之前的吸光值，

所以均未得到二者的完整吸收峰度曲线，但从图1可以看出，3 mL、5 mL、7 mL 的DNS 在480～500nm 有较高的吸光值，由于显色剂本身具有颜色而获得的吸光值将会影响显色液吸光值的可靠性，因此分析波长的选择应避开此范围可消除显色剂对分析的干扰，从图2 可以看出510 nm 具有最大的吸光值，在本实验仪器的基础上，根据图1、图2 可确定λmax=510 nm。