乳酸杆菌的研究进展

乳酸杆菌的研究进展

摘要

乳酸杆菌是一类近年来研究较多的益生素，大量试验结果表明, 乳酸杆菌中的一部分菌种对人和动物的保健和疾病治疗有效果。本文主要介绍了乳酸杆菌的分离与鉴定，菌种的保藏, 代谢产物，生理功能及应用研究，是一种前景广阔的微生态制剂。

乳酸杆菌

乳酸杆菌，是一类能使糖类发酵产生乳酸的细菌，是一群生活在机体内益于宿主健康的微生物。乳酸杆菌存在广泛，其生长温度在20~ 53℃ , 最适温度为30~ 40 ℃；嗜酸性，最适合pH5.5～6.0，在pH3.0～4.5中仍然能生存，在无芽胞杆菌中其耐酸力最强。

乳酸杆菌是一群杆状或球状的革兰氏阳性细菌，不形成芽孢, 触媒阴性,细胞色素缺失,其DNA中G+C含量少于55%。乳酸杆菌绝大多数是厌氧菌或者兼性厌氧的化能营养菌，生长繁殖于厌氧或微好氧、矿物质和有机营养物丰富的微酸性环境中。在污水、发酵生产（如青贮饲料、果酒啤酒、泡菜、酱油、酸奶、干酪）培养物、动物消化道等中乳酸杆菌含量较高。乳酸菌不仅已广泛应用于畜牧业、食品加工业, 随着研究的深入, 也在一些疾病治疗中得以应用, 用于增强患者的免疫、营养、生长刺激等。

乳酸杆菌的分离与鉴定

1 乳酸杆菌的分离

从不同的基质中分离乳酸杆菌时，根据乳酸杆菌所在生长环境的不同以及是否为优势菌可选择不同组分的培养基。主要有以下几种常用的培养基[1]：

（1）MRS 培养基

当乳酸杆菌是待分离区系的优势菌时，常用MRS 培养基对其进行分离。目前

MRS 培养基已经成为国标上公认的用于乳酸杆菌分离较好的培养基，常用于从乳酸杆菌发酵制品中分离菌种以及菌种分离后的传代培养。

（2）RSMA 培养基

RSMA 培养基是近几年发展起来用于乳酸杆菌分离的一种非选择性培养基，由于该培养基中加入0.05%的钌红染料,其最大优点是可以使不同菌种在其表面生长并形成颜色各异易于鉴别的菌落。通常情况下, 乳酸杆菌在RSMA 培养基上形成黄色菌落, 而嗜热链球菌为紫红色菌落, 肠球菌是白色菌落。因此, 简单培养后不用通过常规染色和镜检就可以将乳酸杆菌与其他细菌鉴别开来。ELLI 等应用RSMA 培养基成功的从人粪便样品中分离出了乳酸杆菌[2]。但由于此培养基的营养成分比较单一，所以不适于从菌群组成复杂的环境中分离乳酸杆菌。（3）番茄汁琼脂培养基

这是一种传统的用于分离乳酸杆菌的培养基。此种培养基由于含有一定量的番茄汁，为乳酸杆菌的生长提供必要的营养，使得乳酸杆菌在此环境下更容易生长。但由于配置过程中需要制备新鲜番茄汁，所以操作起来较为费时费力，目前已逐渐被MRS 等培养基所代替。

（4）其他培养基

某些选择性培养基可用于从菌群复杂的基质(例如肠道) 内进行乳酸杆菌的分离。APT 培养基通常用于从肉制品中分离乳酸杆菌，改良的RogosaSL 完全选择性培养基则常用于胃肠内容物中乳酸杆菌的分离[3]。Briggs 琼脂培养基和SL 培养基常用于酸奶中乳酸杆菌的分离[4]。

2 乳酸杆菌的鉴定

2.1 属水平的鉴定[1]

乳酸杆菌属水平的鉴定是乳酸杆菌整体鉴定过程中较为简单且最为基本的步骤，常用的方法是对分纯后的乳酸杆菌培养物进行革兰染色、镜检，选择无分叉的G+杆菌。如果这些无分叉G+杆菌经过培养后，在pH4.5 的条件下能够生长，并且过氧化氢试验、硝酸盐还原试验、联苯胺反应、明胶液化试验、吲哚试验、硫化氢试验均为阴性，即可鉴定其为乳酸杆菌属。

2.2 种水平的鉴定---生化鉴定

乳酸杆菌种水平的生化试验主要采用糖醇类发酵试验。不同乳酸杆菌对糖的利用

情况不一，以此可作为种水平鉴定的依据。传统的生化鉴定方法是配制各种特异性生化反应管，该方法虽然成本较低，但费时费力，不适于大批量样品的快速鉴定，并且反应管种类较少所以结果的判定受到限制。近年来，法国梅里埃公司研发的APl50CH/CHL 鉴定系统是目前国内外应用最广泛、结果准确可靠的快速生化鉴定系统。缺点是价格昂贵，不适于大规模菌种的鉴定。

2.3 株水平的鉴定[1]

脉冲场凝胶电泳( Pulsed-field gel electrophoresis, PFGE)法，目前该法被认为是乳酸杆菌分类鉴定的最好方法。有研究表明, 选用两种选择性较好的内切酶就可以完成PFGE对乳酸杆菌的鉴定, 还可以为判断乳酸杆菌基因组大小和基因图谱的建立提供依据[5]。目前各国学者正致力于乳酸杆菌PFGE 标准方法的建立, 并且在鼠李糖乳酸杆菌、干酪乳酸杆菌、保加利亚乳酸杆菌、嗜酸乳酸杆菌、弯曲乳酸杆菌、植物乳酸杆菌等众多乳酸杆菌株水平的分型鉴定方面取得了良好的分型效果[6],[7]。乳酸杆菌PFGE 鉴定的难点在于内切酶的选择以及电泳条件的优化, 常用的内切酶主要包括ApaI 、NotI、SfiI、AscI、I-CeuI 和SmaI 等。缺点在于PFGE 技术费时费力，但相对于其它方法而言, PFGE 对乳酸杆菌菌株的鉴别比核糖分型技术、十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳等更有为效。

由于乳酸杆菌对人体的作用存在菌株的差异，同一种内不同株间其功能和特性各异，因此对于乳酸杆菌种株水平鉴定技术的研究已成为国内外研究的焦点，也是确保含有乳酸杆菌动物食品安全性的重要保障。目前，基因芯片技术发展迅速，并越来越多地应用于微生物的分型和鉴定，在各种核酸分型鉴定技术成熟稳定后，建立乳酸杆菌的基因芯片技术将指日可待。

菌种的保藏

微生物菌种的保藏方法因微生物种类的不同而异, 其中液氮快速冷冻和冷冻干燥二种方法最佳。但对于乳酸杆菌来说, 它和其它的乳酸菌相比, 在进行冷冻和冷冻干燥处理时其存活力会比较低。王亚珍等人通过在培养基中加入不饱和脂肪酸特别是亚油酸的培养基做为保护剂[8]，增加乳酸杆菌对冷冻或冷冻干燥的耐性，经液氮冷冻或冷冻干燥处理后, 保存的菌种存活率提高了十几倍甚至几十倍。

乳酸杆菌主要代谢产物的种类[9]