中医药研究常用分子生物学技术1

第一章
一、什么是分子生物学

绪论
分子生物学已广泛渗 透到医学科学的各个 领域，成为现代医学 的理论基础。
生 理学 微生物学 药理学 分子 临床 生物学 病理学 各学科 细 胞学 免疫学
二、分子生物学的主要研究内容 （一）分子生物学理论 1、核酸的分子生物学：研究核酸的结构及其功 能 。分子遗传学（moleculargenetics）是 其主要研究内容包括①核酸/基因组的结构， ②遗传信息的复制， ③转录与翻译， ④核 酸存储的信息突变与修复， ⑤基因表达调控 和基因工程技术的发展和应用等。 遗传信息传递的中心法则（centraldogma） 是其理论体系的核心。
二、分子生物学的主要研究内容
（二） 分子生物学技术 2、核酸操作技术 核酸的提取和纯化； DNA、RNA合成技术； DNA重组技术； 核酸杂交技术； DNA序列测定技术等。 3、实用蛋白技术 蛋白质的提取和纯化 ； 蛋白质测定； 蛋白质印迹技术； 蛋白质质谱分析技术等。
二、分子生物学的主要研究内容
（二） 分子生物学技术 1、基本技术 分光光度技术；电泳技术（琼脂糖凝胶电泳，醋 酸纤维素薄膜电泳，聚丙烯酰胺凝胶电泳，等电 聚焦，λ 噬菌体的限制性内切酶酶切片段）； 放射性同位素技术； 色谱技术（层析法，吸附色谱法，分配色谱法， 离子交换色谱法，凝胶色谱法，亲和色谱法，高 效液相色谱法）； 细胞培养等
2、分子生物学技术的应用和发展 ⑴癌基因的发现 ⑵基因诊断 ⑶基因组文库的建立 ⑷基因工程生产人胰岛素 ⑸转基因动物 ⑹人类基因治疗 ⑺基因工程抗体技术的建立和发展 ⑻DNA芯片技术（基因芯片、生物芯片）

3、基因组研究的发展 1977年Sanger测定了Φ X174-DNA全部 5375个核苷酸的序列； 1978年Fiers等测出SV-40DNA全部5224对 碱基序列； 20世纪80年代λ 噬菌体DNA全部48,502碱 基对的序列全部测出； 1996年底许多科学家共同努力测出了大肠 杆菌基因组DNA的全序列长4x106碱基对。 1990~2003年人类基因组计划 （HumanGenomeProject）实施并基本完 成。
（三）初步认识生命本质并开始改造生命的深入 发展阶段

70年代后，以基因工程技术的出现作为新的里程 碑，标志着人类深入认识生命本质并能动改造生 命的新时期开始。其间的重大成就包括：
1967-1970年R.Yuan和H.O.Smith等发现的限制性 核酸内切酶为基因工程提供了有力的工具； 1972年Berg等将SV-40病毒DNA与噬菌体P22DNA在 体外重组成功，转化大肠杆菌，使本来在真核细 胞中合成的蛋白质能在细菌中合成,打破了种属界 限；

这一阶段是从50年代初到70年代初，以1953年 Watson和Crick提出的DNA双螺旋结构模型作为现 代分子生物学诞生的里程碑，开创了分子遗传学基 本理论建立和发展的黄金时代。 Watson和Crick就提出DNA复制的可能模型 。 1956年A.Kornbery首先发现DNA聚合酶 。 1958年Meselson及Stahl用同位素标记和超速离心 分离实验为DNA半保留模型提出了证明 。 1968年Okazaki（冈畸）提出DNA不连续复制模型 。
1、中心法则的建立



（二）现代分子生物学的建立和发展阶段




1972年证实了DNA复制开始需要RNA作为引物 1958年Weiss及Hurwitz等发现依赖于DNA的RNA 聚合酶 1961年Hall和Spiege-lman用RNA-DNA杂交证明 mRNA与DNA序列互补 60年代Nirenberg、Ochoa以及Khorana等几组科 学家的共同努力破译了RNA上编码合成蛋白质的遗 传密码 1970年Temin和Baltimore又同时从鸡肉瘤病毒颗 粒中发现以RNA为模板合成DNA的反转录酶
分子生物学中的两项最重要的实验技术


分子生物学的诞生和发展中的瓶颈 基因克隆（DNA重组，基因工程） (Gene clone, DNA recombination, gene engineering) 基因转移载体的发现 vector DNA操作工具酶的发现 DNA manipulation 基因合成和基因测序 sequence PCR技术 ( polymerase chain reaction)
4、基因表达调控机理





1961年，Jacob，F.和Monod，J.提出了操纵子 模型，打开了人类认识基因表达调控的窗口。 20世纪70年代以后才逐渐认识了真核基因组结构 和调控的复杂性。 1977年最先发现猴SV40病毒和腺病毒中编码蛋 白质的基因序列是不连续的 ，揭开了认识真核基 因组结构和调控的序幕。 1981年Cech等发现四膜虫rRNA的自我剪接，从 而发现核酶（ribozyme）。 20世纪80-90年代，使人们逐步认识到真核基因 的顺式调控元件与反式转录因子、核酸与蛋白质 间的分子识别与相互作用是基因表达调控根本所 在。
2、对蛋白质结构与功能的进一步认识



1956-58年Anfinsen和White根据对酶蛋白的变 性和复性实验，提出蛋白质的三维空间结构是由 其氨基酸序列来确定的。 1958年Ingram证明正常的血红蛋白与镰刀状细 胞溶血症病人的血红蛋白之间，亚基的肽链上仅 有一个氨基酸残基的差别 1969年Weber开始应用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电 泳测定蛋白质分子量 1973年氨基酸序列自动测定仪问世。 中国科学家在1965年人工合成了牛胰岛素 。 在1973年用1.8AX-线衍射分析法测定了牛胰岛素 的空间结构，为认识蛋白质的结构做出了重要贡 献。
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网址：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/（参见教 材P274表7-3）
第一章
绪论
一、分子生物学的含义 广义上，分子生物学是从分子水平研究生命 现象、生命本质、生命活动及其规律的一门 生命学科。 狭义上，分子生物学是一门在分子水平上研 究基因结构和功能的学科。 分子生物学源自遗传学和生物化学，它以核 酸和蛋白质等生物大分子的结构及其在遗传 信息和细胞信息传递中的作用为研究对象 。
二、分子生物学的主要研究内容 （一）分子生物学理论： 1、核酸的分子生物学：研究核酸的结构及其功 能 。
二、分子生物学的主要研究内容 2、蛋白质的分子生物学 研究执行各种生命功能的蛋白质的结构与 功能 。 3、细胞信号转导的分子生物学：研究细胞内、 细胞间信息传递的分子基础。

信号转导机理的研究在理论和技术方面与 上述核酸及蛋白质分子有着紧密的联系， 是当前分子生物学发展最迅速的领域之一。
6、小分子RNA研究进展


1993年，Lee RC等发现线虫（C.elegans）lin-4基因 编码的长度为22~61b的小分子RNA关闭线虫不同发 育阶段mRNA转录的作用 ，这是继核酶以后，内源 性RNA参与基因调节的又一证据。 小分子RNA(miRNA或siRNA）具有调控基因表达的 功能。 miRNA可以通过部分互补结合到目的mRNA的 3′非翻译区，抑制蛋白质合成。这种结合并不诱 导目的mRNA的降解。siRNA能诱导细胞内基因沉默， 与长双链RNA有同源序列的mRNA被降解，从而抑制 基因的表达。
中医药研究常用 分子生物学技术
米丽华 生物教研室 2272304
教学参考资料
1. 2. 3. 4. 5. 6.
唐炳华、王继峰:医学分子生物学(第一版）,中国中医药 出版社,2006年 胡维新:医学分子生物学（第一版）,科学出版社,2007年 T.A.Brown著，魏群等译：基因克隆和DNA分析（第五 版），高等教育出版社，2003年 王艳明、周坤福、徐力：分子生物学与中医药研究，上海 中医药大学出版社，2000年 Robert F. Weaver ： Molecular Biology（3rd ed ）， McGraw-Hill Press.2005 [美]J.萨姆布鲁克 D.W.拉塞尔著，黄培堂等译：分子克 隆实验指南（第三版），科学出版社，2002年
5、细胞信号转导机理研究的深入




1957Sutheland年发现cAMP、1965年提出第二信使 学说，是人们认识受体介导的细胞信号转导的第 一个里程碑。 1977年Ross等用重组实验证实G蛋白的存在和功 能，深化了对G蛋白偶联信号转导途径的认识。 20世纪70年代中期以后，癌基因和抑癌基因的发 现、蛋白酪氨酸激酶的发现及其结构与功能的深 入研究、各种受体蛋白基因的克隆和结构功能的 探索等，使近10年来细胞信号转导的研究更有了 长足的进步。 目前，对于某些细胞中的一些信号转导途径已经 有了初步的认识 。
1、重组DNA技术的建立和发展


1、重组DNA技术的建立和发展

1977年Boyer等首先将人工合成的生长激 素释放抑制因子14肽的基因重组入质粒， 成功地在大肠杆菌中合成得到这14肽 1979年美国基因技术公司用人工合成的人 胰岛素基因重组转入大肠杆菌中合成人胰 岛素。





1、重组DNA技术的建立和发展 我国已有人干扰素、人白介素2、人集落刺激因子、 重组人乙型肝炎疫苗、基因工程幼畜腹泻疫苗等 多种基因工程药物和疫苗进入生产或临床试用 。 1982年Palmiter等将克隆的生长激素基因导入小 鼠受精卵细胞核内，培育得到比原小鼠个体大几 倍的“巨鼠” 。 1991年美国向一患先天性免疫缺陷病（遗传性腺 苷脱氨酶ADA基因缺陷）的女孩体内导入重组的 ADA基因，获得成功。 1994年我国用导入人凝血因子Ⅸ基因的方法成功 治疗了乙型血友病的患者。
1、确定了蛋白质是生命的主要基础物质 2、确定了生物遗传的物质基础是DNA

1944年O.T.Avery等证明了肺炎球菌转化因子是 DNA 1952年A.D.Hershey和M.Cha-se用DNA35S和32P 分别标记T2噬菌体的蛋白质和核酸 ,证明遗传物质 是DNA。
（二）现代分子生物学的建立和发展阶段
二、分子生物学的主要研究内容
（三）分子生物学在医学中的应用 如癌的分子生物学； 免疫分子生物学； 人类基因分析； 基因产物的医学用途； 新药的发现； 基因诊断、治疗； 人类疾病的分子生物学等。
三、分子生物学的发展简史
（一）准备和酝酿阶段

19世纪后期到20世纪50年代初，是现代分子生物 学诞生的准备和酝酿阶段。在这一阶段产生了两点 对生命本质的认识上的重大突破：
1、重组DNA技术的建立和发展 这时期基因工程的迅速进步得益于许多分 子生物学新技术的不断涌现。 1975-1977年Sanger、Maxam和Gilbert 先后发明了三种DNA序列的快速测定法； 1985年Cetus公司Mullis等发明的聚合酶 链式反应（PCR）的特定核酸序列扩增技 术； 90年代全自动核酸序列测定仪的问世。
7.
朱玉贤、李毅、郑晓峰：现代分子生物学（第三版），高 等教育出版社，2007年
教学参考资料
8.
卢圣栋：现代分子生物学实验技术，高等教育出 版社，1993年 J.D.Watson et al Molecular Biology of the Gene 5th The Benjamin /Cummings Publishing Company,Inc.2003 Lewin, B., GENES Ⅷ. University Press, Oxford. 2004 孙乃恩 孙东旭 朱德煦：分子遗传学（第二版）， 南京大学出版社，1997年
二十一世纪生物学的新热点及领域
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结构生物学（Structural Biology） 生物大分子的高级三维结构与功能的统一 生物大分子之间的互作 → 基因的社会学 分子发育生物学（Molecular Developing Biology）