肾性高血压大鼠内皮脂肪酶表达与血管重构的关系及机制初探

论著
肾性高血压大鼠内皮脂肪酶表达与血管重构的关系及机制初探
陈永宏1，周建中2，张松涛1
（1．重庆市长寿区人民医院心内科，重庆401220；2．重庆医科大学附属第一医院心内科，重庆400016）
【摘要】目的检测两肾一夹(2K1C)高血压大鼠大动脉内皮脂肪酶(EL)、核转录因子-κB(NF-κB)及血管重构的
动态变化，探讨EL与血管重构的关系及可能机制。

方法制作2K1C高血压模型，随机分成假手术组(Sham，n=7)、
2K1C4W组(n=7)、2K1C8W组(n=7)、2K1C12W组(n=7)四组，观察四组大鼠血压、血脂、主动脉中层壁厚/管腔内径(MT/LD)变化，用免疫组化观察EL、NF-κB表达，用实时荧光定量RT-PCR检测EL mRNA表达。

结果2K1C8W与12W
组高密度脂蛋白(HDL)水平显著低于Sham组;主动脉MT/LD2K1C各组显著高于Sham组，且随时间延长MT/LD进行
性增大;EL、EL-mRNA、NF-κB表达2K1C各组显著高于Sham组，且随时间延长进行性升高;EL、NF-κB表达与MT/LD正
相关，EL与HDL负相关。

结论高血压大动脉中EL表达明显增高，且与其血管重构关系密切，可能是血管重构机制之一。

【关键词】内皮脂肪酶;血管重构;高血压
【中图分类号】R-332【文献标识码】A【文章编号】1004-0501(2012)12-2065-03
The research of the relationship between the expression of endothelial lipase and vascular remodeling and its mecha-nism in renal hypertensive rats．CHEN Yong-hong1，ZHOU Jian-zhong2，ZHANG Song-tao1．1．The People’s Hospital of Chan-gshou，Chongqing401220；2．The First Affiliated Hospital，Chongqing Medical University，Chongqing400016，China 【Abstract】Objective To explore the relation between endothelial lipase（EL）and vascular remodeling of the main arter-
y and its possible mechanism by detection the dynamic changes of EL，nuclear transcription factor-κB（NF-κB）and vascular re-modeling of the main artery in two-kidney one-clip（2K1C）hypertensive rats．Methods Productive model of2K1C hyperten-sion，were randomly divided into sham operation group（Sham，n=7），2K1C4W group（n=7），2K1C8W group（n=7），2K1C
12W group（n=7）．Blood pressure were detected with the method of tail cuff，lipids with fully automatic biochemical analyzer，the ratio of aortic intima media thickness to lumen diameter（MT/LD）with HE staining，the expression of EL and NF-κB with immu-nohistochemical staining，and the expression of EL-mRNA with Real-time quantitative RT-PCR．Results High-density lipopro-
tein（HDL）levels of2K1C8W and2K1C12W groups was significantly lower than Sham group；Both MT/LD and the expression of EL，EL-mRNA，and NF-κB of2K1C groups was significantly higher than the Sham group，and was gradually increased with time extended；the expression of EL，NF-κB were positively related with MT/LD，negatively with HDL．Conclusion The significantly increased EL expression of the main artery are closely related with vascular remodeling，and may be one of the mechanisms of vas-cular remodeling．
【Key words】endothelial lipase；vascular remodeling；hypertension
内皮脂肪酶（endothelial lipase，EL）是近年发现的脂肪酶家族新成员，由内皮细胞合成分泌并于细胞表面发挥作用，EL可能参与了血管壁重构与动脉粥样硬化［1］。

高血压是动脉粥样硬化性疾病的危险因素，其致血管重构及动脉粥样硬化的机制目前仍不完全清楚。

本研究构建两肾一夹（2K1C）高血压大鼠模型，研究EL、核转录因子-κB（NF-κB）与大动脉重构的动态变化及其相关性，初步探讨EL与高血压血管重构的关系。

1材料与方法
1.1动物模型制备与分组：健康SD雄性大鼠30只，体重（200ʃ20）g，购自重庆医科大学实验动物中心。

随机分成四组：假手术组（Sham，n=7）、其余2K1C三组（2K1C，n=23）。

2K1C高血压大鼠模型按经典2K1C模型方法制备。

术后4周测尾动脉收缩压（SBP）≥150mmHg者为高血压模型制备成功。

将造模成功大鼠21只，随机分成三组：2K1C高血压4周组（2K1C4W，n=7）、2K1C高血压8周组（2K1C8W，n= 7）、2K1C高血压12周组（2K1C12W，n=7）。

2K1C 4W组和2K1C8W组分别在术后4W和8W处死，2K1C12W组和Sham组于术后12W处死。

在实验过程开始、4周、8周、12周用鼠尾测压仪测定血压。

1.2检测指标：①血压，用鼠尾血压仪（淮北正华生物仪器设备有限公司）测量大鼠尾动脉SBP，严格按说明书操作。

每次血压的测量均重复3次，间隔60S，取其均值为最终血压。

②血脂，实验结束时，心脏直视取血2ml用日本日立7/70A自动分析仪（酶法）测定甘油三酯（TG）、总胆固醇（TC）、低密度脂蛋白（LDL）、高密度脂蛋白（HDL）。

③中层壁厚（MT）、管腔内径（LD）、中层壁厚/管腔内径比（MT/LD）测定采用图像分析仪（Image-Pro Plus6.0）在400倍放大时测量，每个标本随机选取3个视野取其均值。

（4）EL和NF-κB 采用免疫组织化学法检测，棕黄色为蛋白阳性表达，图像分析经标准灰度校正后，随机取3个视野，计算平均光密度（AOD）作为阳性表达蛋白半定量。

1.3EL荧光定量RT-PCR检测：处死大鼠后尽快取胸主动脉约2cm投入Hank液中，迅速抽取Hank液约5ml冲净管内血液，保存于液氮罐。

待标本收集齐后用荧光定量RT-PCR仪（Canada，FTC2000）检测EL-mRNA。

1.4统计学方法：用SPSS13.0统计软件进行统计学处理，计量资料以（xʃs）表示，不同时间段各组和Sham 组比较采用单因素方差分析，组间比较用Dunnet-t检验；不同时间段各组两两比较采用t检验；P＜0.05为差异有统计学意义。

相关分析用Spearman线性相关分析。

2结果
2.1各组大鼠各时段血压、血脂水平：2K1C模型4周后血压趋于稳定，维持在160mmHg左右；2K1C8W与12W组HDL显著低于Sham组，2K1C12W组TC、LDL 显著低于Sham组。

各组TG改变无统计学意义。

2.2各组大鼠主动脉重构情况：2K1C各组MT与MT/LD显著高于Sham组，且2K1C4W、2K1C8W、2K1C12W组间MT逐渐增厚，MT/LD逐渐增大，差异有统计学意义。

LD2K1C各组显著低于Sham组，2K1C12W显著低于2K1C4W和8W。

见表1。

表1各组主动脉MT、LD、MT/LD（xʃs）Group n MT（um）LD（um）MT/LD
Sham738.86ʃ6.201337ʃ610.029ʃ0.005
2K1C4W742.86ʃ4.981241ʃ52①0.035ʃ0.004①
2K1C8W755.57ʃ6.19①②1239ʃ49①0.045ʃ0.005①②
2K1C12W778.29ʃ6.42①②③1160ʃ37①②③0.067ʃ0.005①②③注：与Sham比较，①P＜0.05；与2K1C4W比较，②P＜0.05；与2K1C8W比较，③P＜0.05
2.3各组大鼠主动脉免疫组化EL、NF-κB表达情况：EL蛋白主要表达在内皮细胞胞膜及胞浆，胞核也有表达，平滑肌细胞表达较少；NF-κB蛋白在内皮细胞胞核、胞浆与平滑肌细胞胞核、胞浆均有表达。

EL、NF-κB蛋白表达2K1C各组显著高于Sham组，且2K1C4W、2K1C8W、2K1C12W组间比较EL、NF-κB蛋白表达逐渐升高，差异有统计学意义。

见表2。

表2各组主动脉免疫组化EL、NF-κB的AOD（xʃs）
Group n EL AOD NF-κB AOD
Sham70.0471ʃ0.02560.1129ʃ0.0720
2K1C4W70.1357ʃ0.0448①0.2714ʃ0.0662①
2K1C8W70.2157ʃ0.0611①②0.5357ʃ0.1302①②
2K1C12W70.3443ʃ0.1097①②③0.8486ʃ0.2648①②③注：与Sham比较，①P＜0.05；与2K1C4W比较，②P＜0.05；与2K1C8W比较，③P＜0.05
2.4各组大鼠主动脉EL-mRNA荧光定量：EL-mRNA 表达量2K1C各组显著高于Sham组，且2K1C4W、2K1C8W、2K1C12W组间比较表达量逐渐升高，差异有统计学意义。

见表3。

表3各组主动脉EL-mRNA RR（xʃs）
Group n EL-mRNA RR
Sham70.2726ʃ0.1131
2K1C4W70.4427ʃ0.0500①
2K1C8W7 1.5532ʃ0.0959①②
2K1C12W7 1.8878ʃ0.0621①②③注：与Sham比较，①P＜0.05；与2K1C4W比较，②P＜0.05；与2K1C8W比较，③P＜0.05
2.5各组结果间Pearson相关分析：EL-mRNA RR与EL蛋白AOD呈正相关；EL蛋白AOD与HDL呈负相关，与NF-κB蛋白AOD、MT/LD呈正相关；MT/LD与NF-κB蛋白AOD、EL-mRNA RR呈正相关，相关系数r 均有统计学意义（P＜0.05）。

见表4。

表4EL转录、表达水平与HDL、NF-κB表达、MT/LD相关系数（r）
HDL EL-mRNA RR NF-κB AOD MT/LD EL AOD-0.4600.8130.7090.818
MT/LD-0.5540.8560.745
3讨论
高血压是动脉粥样硬化性疾病的危险因素，其发展过程中大动脉的重构日益受到重视，它既是高血压靶器官损害的表现，又是高血压发生、发展的重要病理基础，也是高血压并发动脉粥样硬化的临床前期病变。

本研究发现，随着肾性高血压病程的延长，主动脉中膜逐渐增厚，中膜内平滑肌细胞肥大排列紊乱，弹力纤维层扭曲增多，内皮细胞排列紊乱，内膜略有增厚，部分内皮细胞有脱落，MT/LD随着高血压发展逐渐升高，
提示大动脉存在进行性重构，这和以往报道［2］相似。

EL是脂酶家族新成员，1999年Hirata等［3］首次在培养人脐静脉内皮细胞中克隆出EL，研究表明正常血管内皮细胞表达极低水平的EL，但物理因素（剪切力、血管张力）、内毒素、高脂饮食及促炎因素IL-18、TNF-α等可引起内皮细胞EL表达上调。

Yasushi等［4］研究表明SD大鼠平滑肌细胞体外培养在血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）作用下EL mRNA表达随时间延长进行性上调，在恶性自发性高血压大鼠模型与AngⅡ诱导的高血压大鼠模型的大动脉中也有高表达，推测原因可能为AngⅡ直接作用或大动脉暴露在高血流状态中。

本研究发现，高血压组EL从mRNA和蛋白水平上的表达均显著高于对照组，EL主要表达在内皮细胞胞膜与胞浆，平滑肌细胞表达量很少，且随着肾性高血压病程的发展，EL 逐渐升高，差异有统计学意义；相关性分析提示肾性高血压血管重构和EL的升高呈正相关。

这些结果提示EL与肾性高血压血管重构关系密切，可能参与了肾性高血压大血管重构的发生、发展。

基因打靶及转基因动物实验证实EL是HDL-C代谢的关键酶，EL主要为磷脂酶活性，以HDL为优先底物，主要通过在内皮细胞表面介导HDL与硫酸肝素蛋白多糖结合后，水解HDL［5］。

Yasushi等［4］发现恶性自发性高血压大鼠HDL水平显著降低，而AngⅡ诱导高血压大鼠HDL改变不明显，推测可能与AngⅡ剂量偏小及疗程偏短有关。

本研究发现2K1C高血压大鼠组HDL显著降低，且EL与HDL-C呈负相关，这和Ishida 等［6］研究相似，EL负调节HDL-C与EL增强HDL的结合摄取和增加其胞内代谢有关，同时也与ApoAⅠ、ApoE基因负表达有关。

而HDL在调节内皮细胞调亡与增殖、血管重构、凝血与纤溶、抑制细胞粘附分子表达、血小板聚集与活化等多方面发挥心血管系统的保护作用，提示EL通过降低HDL可能是EL致血管重构及致动脉粥样硬化的机制之一。

本研究发现在肾性高血压发展过程中，大动脉NF-κB表达进行性升高，且与EL表达呈正相关，免疫组化显示其除主要表达在内皮细胞外，也广泛表达在平滑肌细胞，这提示EL可能通过NF-κB通路进行调控。

Qiu G等［7］发现阿托伐他汀通过抑制NF-κB减少了活化巨噬细胞EL的表达，Kempe等［8］进一步鉴定出EL mRNA启动子与NF-κB结合的位点，均支持EL可由NF-κB通路调控。

2K1C高血压大鼠模型血压升高的主要机制为AngⅡ的升高，NF-κB通路激活是AngⅡ导致血管重构的机制之一［9］：AngⅡ是一种促增殖因子，也是一种前炎症因子，有显著促炎作用，诱导产生活性氧，AngⅡ通过活性氧激活NF-κB，进而激活氧化还原敏感的炎症基因表达，如转化生长因子β等。

Ya-suda等［10］发现巨噬细胞EL表达的增加伴随着其结合与摄取LDL的增加，EL也能与循环中细胞（如单核巨噬细胞、白细胞）、血管壁细胞下基质-蛋白聚糖相互作用形成分子桥，促进血液中炎症细胞的粘附、激活及脂蛋白的吸收，提示这可能也是EL导致血管病变及致动脉粥样硬化的机制之一。

综上所述，肾性高血压大动脉中EL表达明显增高，且与血管重构关系密切，可能是血管重构的机制之一，高血压可能部分通过升高EL致动脉粥样硬化的发生，其具体作用机制有待进一步深入研究，动态监测EL的变化及对其调控有重要意义。

参考文献：
［1］Stein Y，Stein O．Lipoprotein lipase and atherosclerosis［J］．Atheroscle-rosis，2003，170（1）：1 9
［2］秦旭平，龙光，徐立朋，等．氯沙坦和培多普利逆转高血压大鼠心血管重构的比较［J］．中国药理学通报，2004，20（10）：1107 1111［3］Hirata K，Dichek HL，Cioffi JA，et al．Cloning of a unique lipase from endothelial cells extends the lipase gene family［J］．Biol Chem，1999，274（20）：14170 14175
［4］Shimokawa Y，Hirata K，Ishida T，et al．Increased expression of endo-thelial lipase in rat models of hypertension［J］．Cardiovasular Re-
search，2005，66（3）：594 600
［5］Desantis P，Coleman T，Schiekofer S，et al．Endothelial lipase：A Key Player in HDL Metabolism Modulates Inflammation and Atherosclerotic
Risk［J］．Med Chem，2008，8（6）：619 627
［6］Ishida T，Choi S，Kundu RK，et al．Endothelial lipase is major determi-nant of HDL level［J］．Clin Invest，2003，111（3）：347 355
［7］Qiu G，Hill JS．Atorvastatin decreases lipoprotein lipase and endotheli-al lipase expression in human THP-1macrophages［J］．Lipid Res，2007，48（10）：2112 2122
［8］Kempe S，Kestler H，Lasar A，et al．NF-kappaB controls the global pro-inflammatory response in endothelial cells：evidence for the regulation
of a pro-atherogenic program［J］．Nucleic Acids Res，2005，33（16）：
5308 5319
［9］Touyz RM．Molecular and cellular mechanisms in vascular injury in hypertension：role of angiotensinⅡ［J］．Curr Opin Nephrol Hyper-
tens，2005，14（2）：125 131
［10］Yasuda T，Hirata K，Ishida T，et al．Endothelial lipase is increased by inflammation and promotes LDL uptake in macrophages［J］．Athero-
scler Thromb，2007，14（4）：192 201
（收稿日期：2012-05-17）。