细菌的特殊染色

细菌的特殊染色
一、实验目的
学习掌握芽孢、荚膜和鞭毛的染色原理和方法。

二、实验原理
芽孢染色法是根据细菌的芽孢和菌体对染料的亲和力不同的原理，用不同的染料进行染色，使芽孢和菌体呈不同颜色而便于区别。

芽孢壁厚、透性低，着色、脱色均较困难，当用弱碱性染料孔雀绿在加热的情况下进行染色时，此染料可以进入菌体及芽孢使其着色，而进入芽孢的染料则难以透出。

若再复染（蕃红液），则菌体呈红色而芽孢呈绿色。

观察荚膜通常采用负染色法，即将菌体染色后，再使背景着色，从而把荚膜衬托出来。

观察鞭毛是采用在染色的同时将染料堆积在鞭毛上使它加粗的方法。

细菌只有在个体发育到一定的时期才具有鞭毛，一般在多次移种之后，在其旺盛生长阶段染色。

三、实验用品
1、器材
（1）显微镜（2）载波片（3）接种环（4）酒精灯（5）香柏油（6）二甲苯（7）无菌水（8）1%盐酸（9）电炉（10）墨汁（11）20%CuSO4 （12））95%乙醇（13）擦镜纸等
2、试剂和材料
（1）菌种：巨大芽孢杆菌、产气肠杆菌、普通变形杆菌等
（2）芽孢染色用7.6%饱和孔雀绿液、0.5%蕃红液（或石炭酸复红液和吕氏美蓝液）。

（3）荚膜染色用刚果红、明胶水溶液、吕氏美蓝液等。

（4）鞭毛染色用硝酸银染色液（A、B液）或Leifson染色液（A、B、C液）。

四、实验方法与步骤
1、芽孢染色：有两种常用的方法。

（1）孔雀绿染色法：取一干净载片按无菌法取巨大芽孢杆菌菌体少许制成涂片，风干固定后，在涂菌处滴加法7.6%的孔雀绿饱和水溶液，染色10分钟后，
用水冲洗，再用0.5%蕃红花红液染色彩1分钟，水洗，风干后镜检。

芽孢
被染成绿色，营养体呈红色。

（2）石炭酸复红染色法：在一支小试管（10×100mm）中，滴入3--4滴蒸溜水，用接种环取巨大芽孢杆菌于水中，充分搅匀，使菌体分散，制成较浓的菌悬液。

然后滴加等体积的(3—4滴) 石炭酸复红液摇匀。

将此试管放入沸水浴中煮10—15分钟，使芽孢及菌体着色。

取此菌液体2—3环在洁净的载片上做成涂片，自然干燥通过火焰固定后，在自来水下缓缓冲洗，使菌体脱色，再用吕氏美蓝液复染1—2分钟。

用水洗去多余染液，轻轻用吸水纸吸去水分，干后镜检，结果可见芽孢被染成红色，菌体呈现蓝色。

2、荚膜染色法
（1）方法
①将刚果红水溶液和明胶水溶液各一滴滴于干净载片上；用接种环蘸取细菌培养液或悬浮液在载片上于上述两滴溶液混匀，自然干燥；滴加1%HCl冲洗，使涂片呈蓝色；用蒸馏水漂洗，除去HCl；，用美蓝复染1分钟，水洗，自然干燥后镜检。

镜检：有荚膜的菌，菌体蓝色，荚膜不着色，背景蓝紫色；无荚膜的菌，菌体蓝色，背景蓝紫色。

由于干燥菌体收缩，菌体四周也可能有一圈狭窄的不着色环，但这不是荚膜。

荚膜不着色的部分宽。

②湿墨汁法
a、制菌液：加一滴墨汁于洁净的波片上，并挑少量菌与其充分混合。

b、加盖玻片：放一清洁盖玻片于混合液上，然后在盖玻片上放一张滤纸，向下轻压，吸收多余菌液。

c、镜检。

结果：背景灰色，菌体较暗，在其周围呈现一明亮的透明圈即荚膜。

③ TyLer法
a 、涂片：按常规法涂片，在空气中自然干燥。

b、染色：用结晶紫冰醋酸染5—7分钟。

c、用20%CuSO4水溶液洗，再用毛边纸吸干。

d、镜检并观察结果：荚膜蓝紫色，细胞暗蓝色。

3、鞭毛染色法
（1）、银盐染色法
①清洗玻片: 选择光滑无裂痕的玻片,最好选用新的。

为了避免玻片向后重叠，应将玻片插在专用金属架上。

然后将玻片置洗衣粉滤过液中（洗衣粉先经煮沸，再用滤纸过滤，以除去粗颗粒），煮沸20分。

取出稍冷后即用自来水冲洗，晾干。

再放入浓洗液中浸泡5—6天。

使用前取出玻片，用水冲去残酸，再用蒸馏水洗。

将水沥干后，放入95%乙醇中脱水。

取出玻片，在火焰上烧去酒精，立即使用。

②菌液的制备及涂片：用于染色的菌种应预先连续移接5至7代。

染色前用于接菌的培养基应是新鲜制备的，表面较湿润，在斜面底部应有少许冷凝水。

将变形杆菌接种于肉汤斜面上，在适宜的温度下培养15至18小时后，用接种环挑取斜面底部菌苔数环，轻轻地移入盛有1毫升与菌种同温的无菌水中，不要振动，让有活动能力的菌游入水中，呈轻度混浊。

在最适温度下保温10分钟，让老菌体下沉，而幼龄菌体在无菌水中可松开鞭毛。

然后从试管上端挑数环菌液，置于洁净玻片的一端，稍稍倾斜玻片，使菌液缓慢地流向另一端。

置空气中自然干燥。

③染色：
a、滴加A液，染4至6分钟。

b、用蒸馏水轻轻地充分洗净A液。

c、用B液冲去残水，再加B液于玻片上，在微火上加热至冒蒸汽，约维
持0.5至1分钟（加热时应随时补充蒸发掉的染料，不可使玻片出现干
涸部分）。

d、用蒸馏水洗，干燥。

f、镜检
结果：菌体和鞭毛呈深褐色至黑色。

（2）、Leifson 染色法
①清洗玻片法同1。

②菌液的制备及涂片
a 、菌液的制备同1
b、用削尖腊笔在洁净玻片上划分3至4个相等的区域。

c、放一小环菌液于每一区的一端，将玻片倾斜，让菌液流向另一端。

在另一端用一张吸水纸吸去多余的菌液。

d、涂片在空气中自然干燥。

③染色
加染色液于第一区，使染料覆盖涂片。

隔数分钟后染料加入第二区，以后依此类推（相隔时间可自行决定），其目地是由于染色时间长短受菌种、室内温度、湿度等因素的影响。

这样便于确定最合适的染色时间，且节省材料。

在染色过程中要仔细观察。

当整个玻片出现铁锈色沉淀和染料表面出现金色膜时,就可用水轻轻地冲洗,一般约10至15分钟.
④水洗:在没有倾去染料的情况下就用自来水轻轻洗去染料,否则会增加背景的沉淀。

自然干燥。

⑤镜检。

结果：细菌和鞭毛都染成红色。

五、实验结果
观察你所染色的细菌结果。

六、思考题
1、芽孢染色为什么要加热或延长染色时间？
2、说明芽孢染色自来水冲洗的作用。

3、荚膜染色涂片时为什么不加热固定？
4、说明荚膜染色（TyLer法）中硫酸铜的作用。

5、鞭毛染色为什么用培养12至18小时的菌体？为什么要连续多次的传代？
6、鞭毛染色在制片时能否用加热固定？为什么？。