应用TaqMan探针技术检测MTHFR基因的C677T和A1298C多态性

应用TaqMan探针技术检测MTHFR基因的C677T和A1298C多态性

作者：潘欣等

来源：《医学信息》2014年第11期

摘要：目的探讨一种快速、准确运用于临床检测MTHFR基因多态性的方法。方法提取43例胃癌患者的外周血基因组DNA，用TaqMan探针技术对MTHFR基因的C677T和

A1298C两个多态性位点进行分型，并采用直接测序法对TaqMan探针分型结果进行验证。结果 43例样本的MTHFR C677T基因型分别为14例CC、23例CT和6例TT；A1298C基因型为24例AA、18例AC、1例CC，两种分型方法结果一致。结论本研究选用的TaqMan探针分型方法结果准确可靠，能够用于MTHFR的C677T和A1298C两个多态性位点分析。

关键词：TaqMan探针；MTHFR；多态性；DNA测序；胃癌

胃癌（Gastric cancer）是世界范围内的高发肿瘤之一[1]。近年研究表明，低叶酸水平可增加包括胃癌在内的许多肿瘤发生的危险性[2]。亚甲基四氢叶酸还原酶（methylene tetrahydrofolate reductase，MTHFR）是叶酸代谢途径中的一关键酶，MTHFR参与的体内同型半胱氨酸（Hcy）和甲硫氨酸之间的循环反应，反应中生成的S腺苷甲硫氨酸（SAM）是体内代谢唯一的甲基供体，涉及DNA的修复与合成，影响DNA代谢，与许多肿瘤化疗药物的疗效相关。

MTHFR的活性很大程度上可能受基因多态性的影响，从而影响疾病的发生和药物的疗效。MTHFR基因C677T和A1298C为两个常见的多态性位点，有研究表明该位点的基因多态性会导致MTHFR酶活性的改变[3]，可能导致患者之间出现较大的个体差异。因此，测定MTHFR的基因型对疾病的预防和合理用药有重要的意义。现已有的MTHFR基因多态性的研究，大多数采用限制性片段长度多态性聚合酶链反应（PCR-RFLP）技术，该技术不仅费时，且易污染造成假阳性。不适宜用于临床检测。本研究旨在探讨一种可用于临床快速准确检测MTHFR基因型的方法，故选用TaqMan探针技术对MTHFR的C677T和A1298C两个多态性位点进行分型。

1资料与方法

1.1一般资料经CT、MRI或病理组织学活检确诊的胃癌患者43例，来源于昆明医科大学第一附属医院，收集样本人群的外周静脉血2 mL。采用Genomic DNA Purification Kit （PROMEGA公司）对基因组DNA进行提取，使用Nanodrop 2000测定DNA的浓度和纯度。

1.2 TaqMan探针技术检测MTHFR基因C677T和A1298C位点的多态性 TaqMan探针试剂由ABI公司为MTHFR基因C677T（SNP ID：rs1801133），A1298C（SNP ID：rs1801131）多态性设计的TaqMan SNP分析试剂，每个位点的TaqMan SNP基因分型试剂中，含有两条MGB探针。MTHFR C677T一条以VIC荧光标记碱基G，对应样本基因突变位点C；一条以FAM荧光标记碱基A，对应样本基因突变位点T。MTHFR A1298C一条以VIC荧光标记碱基G，对应样本基因突变位点C；一条以FAM荧光标记碱基T，对应样本基因突变位点A。探针序列，见表1。

MTHFR C677T及A1298C多态性 real-time PCR采用25 μL反应体系：40×SNP Genotyping Assay Mix：0.625μL；TaqMan 2×PCR Master Mix：12.5 μL；DNA模板：1 μL；dd H2O：10.875 μL。探针检测在BIO-RAD IQ5实时荧光PCR仪上进行。反应条件为：95℃预变性10 min；95℃，15 s；60℃，1 min，共40个循环。由于仪器的限制，本研究使用的BIO-RAD

IQ5实时荧光PCR仪中没有VIC荧光检测通道，我们选择了HEX荧光通道替代，两种荧光相差1nm波长。

1.3 DNA测序法验证TaqMan探针技术检测MTHFR基因多态性

1.3.1目的片段的扩增设计MTHFR C677T及A1298C两个多态性位点的测序引物（Invitrogen公司合成），引物序列，见表2。

2结果

2.1 Taqman探针基因型分析 MTHFR C677T和A1298C real-time PCR散点图基因分型结果分别，见图1、图2。

2.2 DNA测序验证采用Lansergene SeqMan软件分析测序结果。

2.3 MTHFR基因多态性分型结果 43例样本MTHFR C677T基因型分别为野生纯合型CC 14例（32.5%）、突变杂合型CT 23例（5

3.5%）及突变纯合型TT 6例（1

4.0%）。A1298C基因型分别为AA 24例（5

5.8%）、AC 18例（41.9%）、CC 1例（2.3%）。本研究中，TaqMan 探针技术检测及DNA测序验证，两种检测方法得到的基因分型结果一致。

3讨论

中国是个胃癌高发的国家，每年新发病例数占全球总数的40%。胃癌化疗方案众多且无标准方案，目前临床应用最广泛的是基于氟尿嘧啶类药物的化疗方案，在实际的化疗过程中，氟尿嘧啶类药物的个体差异较大，氟尿嘧啶类药物在体内均需转化为5-FU，继而发挥抗肿瘤作用。MTHFR是5-FU代谢中的一个关键酶，5-FU的活性代谢产物还原型叶酸（CH2FH4）在

MTHFR的作用下转变为5-甲基四氢叶酸，使CH2FH4与胸腺嘧啶核苷酸合成酶（TS）、三磷酸氟尿嘧啶脱氧核苷（FdUTP）组成的三元复合物减少，从而削弱5-FU的抗肿瘤作用。

C677T突变产生丙氨酸被缬氨酸取代的错义突变，其合成的蛋白质会出现热稳定性降低和酶活性的改变[4]。有研究提出，MTHFR基因的C677T多态性通过影响DNA甲基化和核酸稳定性，参与了胃癌的发生。A1298C突变使得编码后谷氨酰胺被丙氨酸替代，有报道称[5]纯合子突变型可使酶活性降低到正常值的60%左右。因此，测定MTHFR的基因型对肿瘤患者的个体化用药具有至关重要的意义。

但是，常规实验室多应用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）的方法检测MTHFR的基因多态性，该方法需要用凝胶电泳对扩增产物进行分析，易造成样本间污染，影响结果判读。TaqMan探针技术省时、简单、准确、安全、实时分析是它突出的优点[6]。同时，TaqMan探针在闭合单管中进行检测，避免了由样本间污染造成假阳性的结果[7]。

在我们的研究中，为了进一步验证TaqMan方法的准确性，我们进行了DNA测序验证，与TaqMan探针基因分型结果相比较，发现结果完全一致。本研究采用的TaqMan探针分型方法结果准确可靠，故我们认为使用TaqMan技术为MTHFR C677T及A1298C基因多态性分型可用于临床检测。TaqMan探针基因检测法具有很好的临床实用性，是临床快速诊断MTHFR 基因型较有价值的方法。

参考文献：

[1]Meyer H J，Wilke H.Treatment strategies in gastric cancer[J].Dtsch Arztebl Int.2011，108（41）：698-705，706

[2]Choi S W，Mason J B.Folate status：effects on pathways of colorectal carcinogenesis[J].J Nutr.2002，132（8 Suppl）：2413S-2418S.

[3]Etienne M C，Formento J L，Chazal M，et al.Methylenetetrahydrofolate reductase gene polymorphisms and response to fluorouracil-based treatment in advanced colorectal cancer

patients[J].Pharmacogenetics.2004，14（12）：785-792.

[4]Ulrich C M，Robien K，Mcleod H L.Cancer pharmacogenetics：polymorphisms，pathways and beyond[J].Nat Rev Cancer.2003，3（12）：912-920.

[5]Warren R B，Griffiths C E.The potential of pharmacogenetics in optimizing the use of methotrexate for psoriasis[J].Br J Dermatol.2005，153（5）：869-873.