人类免疫缺陷病毒抗体检测

人类免疫缺陷病毒抗体检测（ELISA）

1. 原理

在微孔条上预包被纯化基因工程人类免疫缺陷病毒I型和II型（HIV-1/HIV-2）抗原（合成肽或基因重组蛋白），采用双抗原夹心法检测血清或血浆中人类免疫缺陷病毒抗体。样品加入包被抗原反应孔，在随后的温育过程中，若样品中含特异抗体，则该抗体与包被抗原形成抗原抗体复合物被吸附到固相，再加入酶标记的HIV-1/HIV-2抗原，最终形成抗原-抗体-酶标抗原复合物，洗涤除去未结合的游离酶，加入显色剂后显色。

2. 标本采集

2.1 采集前病人准备：受检者应空腹

2.2 标本种类：血清或血浆

2.3 标本要求：采集病人静脉血2ml（可用EDTA抗凝），室温放置不超过4小时，分离血清备用。

3. 标本储存：2-8°C保存不应超过48小时，-20°C不应超过3个月，-70°C 长期保存，应避免反复冻融。

4. 标本运输：密封，室温运输。

5. 标本拒收标准：污染、标本量不足、严重溶血或脂血标本不宜作此项检测。

6. 试剂

6.1 试剂名称：人类免疫缺陷病毒抗体诊断试剂盒

6.2 试剂生产厂家：北京万泰生物工程有限公司。

6.3 包装规格：96Test/Kit

6.4 试剂盒组成：包被反应板，HIV酶标记物，阳性对照血清，阴性对照血清，浓缩洗涤液，底物A，底物B，终止液，封口膜，密封袋。

6.5 试剂储存条件及有效期：2-8°C避光保存，有效期6个月。

7. 仪器设备

7.1 仪器名称：自动酶标仪

7.2 仪器厂家：Rayto

7.3 仪器型号：RT-6100

8. 操作步骤

8.1 平衡：将试剂盒各组分取出，平衡至室温（18-25°C），微孔板开封后，余者及时以自封袋封存。

8.2 配液：浓缩洗涤液配制前充分摇匀（如有晶体应充分溶解），浓缩洗涤液和蒸馏水或去离子水按1：19稀释后使用。

8.3 编号：将微孔条固定于支架，按序编号。

8.4 加样：用加样器在微孔反应条板孔中加入样品100l；空白孔不加任何液体；阴性对照孔和阳性对照孔，每孔分别加入阴阳对照各100l，标好位置。对照应在所有标本加完以后再加，以保证阈值准确性。

8.5 温育（一）：充分混匀，加上封板膜，置37℃温育60分钟。

8.6 洗涤（一）：用洗涤液充分洗涤5次，洗涤完扣干（每次应保持30-60秒的浸泡时间）。

8.7 加酶：分别在每孔中加入酶标记物100l，轻拍混匀。

8.8 温育（二）：充分混匀，加上封板膜，置37℃温育30分钟。

8.9 洗涤（二）：用洗涤液充分洗涤5次，洗涤完扣干（每次应保持30-60秒的浸泡时间）。

8.10 显色：每孔加入底物A、B各50l，轻拍混匀，置37℃暗处30分钟。

8.11 终止：每孔加终止液50l，混匀。

8.12 测定：用酶标仪单波长450nm或双波长450/630nm测定各孔OD值（用单波长测定时需设空白对照一孔，30分钟内完成测定，并记录结果）。

9. 结果判断与分析

9.1 临界值（C.O.）的计算：临界值＝0.15＋阴性对照平均OD值。

9.2 结果判定：样品OD值S/C.O>=1者为阳性

样品OD值S/C.O<1者为阴性

9.3 正常时，阴性对照OD值应<=0.12，阳性对照OD值应>=0.80，

阴性对照若小于0.08以0.08计算。

9.4 若阳性对照OD值超出正常范围或其孔间之差大于30%，应重复试验。

9.5 初次试验阳性者应重新取样进行双孔复试，按全国HIV检测管理规范的要求，须将血样或重新采血送HIV确认实验室做确认试验，确认报告阴性者，血可以发放使用；凡确认实验阳性和可疑者，血不能发放使用，统一送确认实验室处理。

10. 质量控制：每次测定均做双孔或以上复试；阴阳对照OD值应在要求范围内。

11. 参考范围：阴性

12. 临床意义：在血清中HIV抗体的存在表明可能有人类免疫缺陷病毒感染。

13. 操作性能：灵敏度、特异性高。

14. 方法局限性

14.1 只能用作HIV抗体检测的初筛试验。

14.2 样品显色深浅与样品中抗体的含量没有一定正相关。

15. 病危报警值的处理：初次试验阳性者应重新取样进行双孔复试，按全国HIV检测管理规范的要求，须将血样或重新采血送HIV确认实验室做确认试验；通知防保科和临床申请医生。