纳米金_蛋白A介导抗体定向固定的压电传感及...

V o l.26高等学校化学学报　N o.2　2005年2月 CH E M I CAL JOU RNAL O F CH I N ESE UN I V ERS IT IES 222～226　

纳米金-蛋白A介导抗体定向固定的

压电传感及电化学特性研究

丁艳君,王　桦,李继山,沈国励,俞汝勤

(湖南大学化学化工学院,化学 生物传感与计量学国家重点实验室,长沙410082)

摘要　以纳米金为载体标记蛋白A(PA),用于介导抗体在压电石英晶体金电极表面的定向固定化.以补体C1q抗体为模型,采用压电传感技术实时监察了此敏感界面的免疫反应过程,并考察了与补体C1q免疫反应的压电响应性能.金标PA固定抗体的方法与传统的直接PA固定化方法相比较,具有传感界面无需活化,固定抗体的免疫活性高等优点,可对相应抗原进行高灵敏的压电免疫检测.分别利用循环伏安和电化学交流阻抗技术对金标PA固定抗体及其免疫反应的动力学过程进行了表征.

关键词　纳米金;抗体固定化;石英晶体微天平;循环伏安;电化学阻抗谱

中图分类号　O657 文献标识码　A 文章编号　025120790(2005)022*******

在免疫检测过程中,抗体的定向固定有利于抗体免疫性能的充分发挥[1].最常用的定向固定化方法是通过利用蛋白A特异结合抗体F c端的特性来固定抗体,应用于生化目标物的免疫检测[2～4].但在传统的基于PA的定向固定化方法中,PA是直接吸附于金电极表面的.由于平板金容易引起蛋白质的变性[5],降低了PA的活性,进而影响了其结合抗体的能力.近年来,新型纳米功能化材料的应用为构建高性能的免疫传感技术平台提供了潜在的可能性,利用纳米金颗粒固定酶、DNA及抗体等发展纳米颗粒增强的电化学和压电传感技术的报道较多[6～11].此外,一些电化学技术如循环伏安(CV)和电化学阻抗谱(E IS)已逐步应用于电极表面修饰层的表征,为评价许多生物体系电化学特性提供了无损的分析手段[10～13].

本文通过纳米金标记PA将补体C1q抗体定向固定于石英晶振表面,用于压电免疫传感测定C1q抗原.分别采用压电和电化学方法考察了抗体的固定化及其免疫反应过程,并与传统的PA固定法进行了比较.结果表明,以纳米金标记PA作界面固定抗体时具有固定量大、免疫活性高等特点;所构建的压电传感器响应信号大,检测灵敏度较高.同时按以上步骤修饰金电极表面,采用电化学交流阻抗谱表征了不同固定化方法对抗体的固定量及免疫反应的影响.实验结果表明,该固定化方法所构建的免疫传感技术平台可推广用于设计其它各种免疫传感器的敏感界面.

1　实验部分

1.1　仪器与试剂

9M H z A T2切型双面镀金石英晶振(Q C M,北京晨兴无线电器四厂),晶振的一面用O型橡胶圈和塑料片封闭,使之单面触液;联机的压电分析仪(Q CA922,P rinceton A pp lied R esearch);JB22型磁力搅拌器(上海分析仪器厂);CSS501型恒温箱(重庆实验装备厂);TCL216A台式高速冷冻离心机(长沙平凡仪器仪表有限公司);三电极系统:修饰的金电极为工作电极,铂电极为对电极,饱和甘汞电极(SCE)为参比电极;VM P2型多通道恒电位仪(P rinceton A pp lied R esearch).

补体C1q抗血清(C1q A b,效价1∶150)和C1q抗原(C1q,8417Λg mL)以及PA均购于卫生部上海生物制品研究所;HA uC l4和柠檬酸三钠购于中国医药集团上海化学试剂有限公司;聚乙二醇(PEG)购

收稿日期:2004204207.

基金项目:国家自然科学基金(批准号:20075006,20375012和20205004)及教育部博士学科点基金(批准号:20010532008)资助.

联系人简介:沈国励(1938年出生),男,教授,博士生导师,主要从事化学与生物传感技术的研究.E2m ail:glshen@

于天津天泰精细化学药品有限公司;不同pH 值的PBS 溶液采用0101mo l L N a 2H PO 4和0101mo l L KH 2PO 4配制;P iranha 试剂为按体积比3∶7配制的H 2O 22H 2SO 4混合液;实验中所用的其它试剂均为分析纯;水为重蒸水.

1.2　纳米金胶的制备

参照文献[14]方法制备金胶.所用的玻璃器皿均用王水洗净,HA uC l 4溶液和柠檬酸三钠溶液在使用前以0145Λm 孔径的滤膜过滤

.取100mL 0101%的HA uC l 4溶液于蒸馏瓶中,加热煮沸,在剧烈搅拌下快速加入4mL 质量分数为1%的柠檬酸三钠溶液,搅拌煮沸30m in ,至出现橙红色后停止加热,继续搅拌10m in ,即制得平均粒径为15nm 的金胶.将制备的金胶置于棕色瓶中,于4℃下保存备用.

1.3　纳米金胶标记PA 的制备

参照文献[15]方法,将待标记的PA 预先在01005mo l L N aC l 溶液(pH 710)中于4℃下透析过夜,再经100000×g 于4℃下离心1h ,以除去聚合物.按30Λg PA 中加入10mL 金胶粒的比例,将高纯度的PA 溶于012mL 纯水后,再与胶体金(调至pH =610)混合.3m in 后,在每25mL 结合物内加入质量分数为1%的PEG (分子量为20000)溶液1mL ,再用60000×g 离心45～60m in ,得到沉积于离心管底部的深红色沉淀物,即为纯化的金标PA 结合物.用0101mo l L PBS (pH =712)混悬,重复以上操作2次,以除净未结合的PA .最后用含质量分数为0105%的PEG 及0102%的N a N 3的PBS 将结合物重新混悬为115mL ,于4℃下保存备用.

1.4　压电传感性能的检测

1.4.1　抗体的包被固定　晶振在使用前用P iranha 试液洗净,水洗,干燥.滴加30ΛL 金标PA 于晶振表面,于4℃冰箱中放置24h 后,取出水洗,干燥,即可在晶体金电极表面形成一金标PA 层.再取20ΛL C 1q A b (效价1∶100),用pH =519的PBS 溶液稀释至30ΛL ,将其滴加于晶体金电极表面,于37℃下温育45m in ,取出水洗,干燥备用.

1.4.2　测定方法　将包被了抗体的石英晶振安装在盛有310mL PBS 缓冲液(pH =710)的检测池中,在不断搅拌下进行测定,待晶振频率稳定后,迅速注入一定浓度的待测C 1q ,记录其频率响应值.

1.5　电化学特性分析

按照文献[16]方法,采用传统的三电极系统,将修饰好的电极于510mmo l L K 3Fe (CN )6

K 4Fe (CN )6(体积比1∶1)和011mmo l L KC l 的混合溶液中扫描,记录电极的循环伏安图

.以相同方法修饰的金电极(直径1mm )为工作电极,在振幅为10mV ,频率为100000～110H z 范围内记录电化学阻抗图.

2　结果与讨论

2.1　金标PA 的制备

表面带负电荷的胶体金与带正电荷的蛋白质分子容易相互吸引,形成牢固的结合物,而不影响蛋白质的生物活性.在标记过程中发现,金胶溶液的pH 值对金标PA 的稳定性影响较大.以金胶溶液的

pH 值范围为519

～612(PA 的等电点附近)时为最佳,并在pH =611时显示了相当强的稳定性,未观察到任何凝聚现象和颜色变化.此结果与文献[15]记载基本相符.

2.2　抗体的固定化条件

2.2.1　pH 值的影响　考察了以金标PA 膜作为传感器界面固定抗体时溶液酸度的影响.当pH 值在513～619范围内时,晶振包被C 1q A b 显示出较大的固定量;并在pH 值为519时,抗体的固定量达到最大.此外,将涂有金标PA 膜的石英晶振于不同pH 值(415～912)的PBS 空白溶液中浸45m in ,发现晶振的频率变化仅在15H z 以内,表明金标PA 膜在pH 415～912范围内具有较大的稳定性.因此,当溶液的pH 值在中性偏弱酸性情况下,较适合于金标PA 吸附固定蛋白质.

2.2.2　抗体稀释比的影响　在包被时间和pH 值一定的情况下,考察了抗体溶液稀释比浓度的影响,实验结果表明,抗体溶液的稀释比为1∶115时,晶振的频率响应值最大,超过此浓度后,频率响应逐322N o .2丁艳君等:纳米金2蛋白A 介导抗体定向固定的压电传感及电化学特性研究