一种简捷检测重组痘苗病毒蚀斑的方法

昆明医学院学报2009，（3B）：1~4CN53-1049/R Journal of Kunming Medical University论著一种简捷检测重组痘苗病毒蚀斑的方法文喻玲，李传印，范耀春，张艳，魏海涛，陈元鼎（中国医学科学院北京协和医学院医学生物学研究所，云南昆明650118）［摘要］目的建立一种简捷准确测定重组痘苗病毒滴度的方法．方法重组痘苗病毒vTF7-3经胰酶处理后，在37℃，吸附M A104细胞单层2h，覆盖不同的覆盖物.（1）琼脂法：细胞单层覆盖琼脂-M EM营养层，孵箱培养3～4d后，用含中性红的第二层营养琼脂覆盖，4h后计数病毒蚀斑；（2）甲基纤放37℃，5%CO2维素法：细胞单层覆盖甲基纤维素-M EM营养液，放37℃，5%CO孵箱培养3～4d后，吸出营养液，用结晶2紫染色20min后计数病毒蚀斑．结果琼脂法和甲基纤维素法中痘苗病毒vTF7-3的蚀斑均呈圆形，大小均匀，边缘清晰光滑，但甲基纤维素法中痘苗病毒的斑型较大，滴度较高，操作简单．琼脂法蚀斑平均滴度为1.27×109/mL，甲基纤维素法蚀斑平均滴度为1.54×109/mL，统计学分析二者差异无统计学意义（P＞0.05）．结论琼脂法和甲基纤维素法均可用于测定重组痘苗病毒滴度，甲基纤维素蚀斑法优于琼脂法．［关键词］重组痘苗病毒；蚀斑滴定；甲基纤维素［中图分类号］R34［文献标识码］A［文章编号］1003－4706（2009）3B－0001－05A Simple Met hod for Plaquing Assay of Recombinant VacciniaVir usWEN Yu－ling，LI Chuan－yin，FAN Yao－chun，ZHANG Yan，WEI Hai－tao，CHEN Yuan－ding （Institute of Medical Biology，Chinese Academy of Medical Science&Peking Union Medical College，Kunming Yunnan650118，China）［Abstract］Objective To establish a simple，quantitative and stable method for plaquing assay of recombinant vaccinia virus．Methods The trypsin treated vaccinia was absorbed onto MA104cells for two hours. Infectious titers of the virus were measured by two diffirent plaquing assays:（1）the cell monolayer was overlayed with MEM-agar and incubated at37℃in5%CO2for3～4days，then added the second overlay（containing neutral red）and plaques were calculated.（2）the cell monolayer was overlayed with M EM-methyl cellulose and incubated at37℃in5%CO2for3～4days，then the cell layers were stained with crystal violet and plaques were calculated．Results Round，even and clear plaques formed in cell monolayers in M EM-agar and MEM-methyl cellulose overlayer methods，and M EM-methyl cellulose overlayer method was simpler than M EM-agar overlayer method with a little bigger plaques and higher titers．Conclusion M EM-agar and M EM-methyl cellulose overlayer methods can be used for detection of vaccinia virus PFU titers and M EM-methyl cellulose overlayer method is better.［Key words］Recombinant vaccinia virus；Plaquing assay；M ethyl cellulose［作者简介］文喻玲（1955～），女，重庆市人，大专，主管技师，主要从事病毒学、分子生物学研究工作.［通讯作者］陈元鼎．E-mail:chenyd@第30卷昆明医学院学报2痘苗病毒、天花病毒、牛痘病毒和猴痘病毒均属痘病毒科正痘病毒属，是结构最为复杂的一类DNA病毒[1]，可引起人兽共患疾病．重组痘苗病毒，是在痘苗病毒中导入目的基因的病毒，近年来常用其作为真核表达系统，在病毒基因工程技术和在重组疫苗的发展中起到了重要的作用．为了更好的应用重组痘苗病毒，有必要研究出一种痘苗病毒快速准确检测的方法．常用的病毒滴定方法有两种，即以微量细胞病变为基础的组织细胞培养半数感染剂量（TCID50）和以蚀斑形成单位（PFU）为基础的蚀斑滴定法．TCID50只能测定使50%细胞感染的病毒剂量，而不能准确测出感染性病毒的颗粒数，而蚀斑法则能准确测出病毒样品中感染性病毒颗粒数，是目前病毒感染性滴度定量测定中较可靠的一种方法[2]．本研究主要运用不同的覆盖物蚀斑滴定方法对重组痘苗病毒vTF7-3进行测定，从所得到的结果比较分析，在本实验室建立一种较为简便易行准确的测定痘苗病毒感染性的蚀斑滴定方法．1材料与方法1.1材料1.1.1细胞传代恒河猴肾细胞（MA104），传代人宫颈癌细胞（HeLa），由本实验室保存．用含10%血清M EM营养液培养至单层．1.1.2病毒毒种重组痘苗病毒vTF7-3[3]，由本实验室保存．病毒液用HeLa细胞单层增殖，培养液为2%血清M EM营养液．1.1.3试剂M EM（Sigma公司），牛血清（杭州四季清公司），胰酶（进口），牛血清白蛋白（BSA，晶美公司），琼脂（DIFCO），甲基纤维素（英国），中性红（BBI公司）．1.2方法1.2.1重组痘苗病毒vTF7-3的制备解冻后的重组痘苗病毒vTF7-3液，加入终浓度为0.25mg/mL 的胰酶，混匀后放37℃水浴30min，1:50稀释后种入HeLa细胞单层，放37℃吸附2h时．在此期间每隔10～15min晃动一次．吸弃病毒吸附液，加入含2%血清MEM培养液．放37℃恒温培养36～48h，至细胞单层出现80%或以上细胞病变，用0.125%胰酶消化，加入适量维持液，收集感染细胞，经3000r/min，4℃离心30min，收集沉淀（即感染细胞），用Tris-HCl，pH9，1mM EDTA缓冲液悬浮．冻融3次，4000r/min，4℃，离心30min．收集上清（病毒液），分装，于-20℃低温保存待测．1.2.2感染性滴度（TCID50）的测定预先接种M A104和HeLa细胞至96孔培养板各一板，培养成单层，备用．按常规方法稀释病毒并滴定，于37℃，5%CO2孵箱培养5d，每天观察细胞病变，以病毒使50%的MA104或HeLa细胞发生病变的最高稀释度对数的倒数判定结果．用Reed-M uench法计算出TCID50值．1.2.3蚀斑滴度（PFU）的测定（1）琼脂蚀斑法:预先接种M A104细胞至6孔板，培养成单层，备用．用PBS洗2次，MEM维持液洗1次．取vTF7-3重组痘苗病毒液0.1mL，加入终浓度为0.25mg/mL的胰酶，混匀后放37℃水浴30min．用无血清M EM溶液作10倍连续稀释，取10-5～10-9稀释度的病毒液，分别加入6孔板细胞单层中，500μL/孔，同时设细胞对照孔．放37℃，5%CO2孵箱吸附2h，每隔10～15min晃动一次．吸出病毒吸附液，用MEM维持液洗细胞孔2次．用1%琼脂/4%血清/MEM营养液覆盖，2 mL/孔，放37℃，5%CO2孵箱培养至第4天，加入含0.04%中性红/1%琼脂营养液覆盖，1mL/孔，放37℃4h后即可观察到空斑．计数以上各稀释度培养孔中的病毒蚀斑数，计算病毒蚀斑滴度（PFU/mL）．以l g PFU/mL表示病毒蚀斑滴度．（2）甲基纤维素蚀斑法细胞培养、病毒稀释、种毒和吸附与前相同，用M EM维持液洗细胞后加入1.2%甲基纤维素4%血清/MEM营养液覆盖，2mL/孔．放37℃，5%CO2孵箱培养4 d．每天镜下观察，当细胞病灶约1～2mm时，用0.2%结晶紫/10%甲醛染色20min，水洗．计数以上各稀释度培养孔中的病毒蚀斑数，计算病毒蚀斑滴度（PFU/mL）．以l g PFU/mL表示病毒蚀斑滴度．病毒蚀斑形成单位滴度（PFU/ml）的计算方法，以每毫升中所含的蚀斑形成单位的数目来表示．用公式：A＝a×bA:每毫升病毒中蚀斑形成单位的数目；图1HeLa 细胞和MA104细胞感染痘苗病毒vTF7-3后的细胞病变形态（×100）文喻玲，等．一种简捷检测重组痘苗病毒蚀斑的方法3第3B 期a ：平均每孔中出现的蚀斑数；b ：病毒稀释倍数；v ：每孔接种的病毒体积（mL ）.2结果2.1重组痘苗病毒的感染性滴度重组痘苗病毒感染HeLa 细胞约30h 后开始出现病变（见图1），42h 80%以上大量细胞圆缩，少量病变细胞开始脱落（见图1C ）．此时收获病毒的感染滴度较高．未感染病毒的细胞对照形态保持正常，见图1A ．用MA104和HeLa 细胞微量细胞病变法测定痘苗病毒的感染性滴（TCID 50）时，当MA104细胞感染病毒（10～6）24h 时左右可出现明显的细胞病变（见图1b ），42h 后可见细胞病变呈拉网状（见图1c ）．当HeLa 细胞感染病毒（10～6）24h 左右，可见有少量细胞堆积，无病灶细胞现象，见图1B ，42h 后可见大面积（80%以上）被感染的HeLa 细胞形态发生改变并皱缩，见图1C ．用M A104细胞滴定的平均滴度为1×108TCID50/0.1mL ．用HeLa 细胞滴定的平均滴度为4.4×107TCID50/0.1mL．CAB ca b 2.2蚀斑法测定重组痘苗病毒滴度2.2.1覆盖琼脂蚀斑滴定MA104细胞单层吸附vTF7-3病毒2h 后，分别覆盖2层营养琼脂（详见2.3.1），4d 后，可见明显的空斑形成，见图2．斑呈圆型，大小均匀，约1mm 左右，边缘光滑清晰．琼脂蚀斑法滴定重组痘苗病毒vTF7-3的平均滴度为1.27×109PFU/mL ．2.2.2覆盖甲基纤维素蚀斑滴定M A104细胞单层吸附vTF7-3病毒2h 后，吸出细胞培养孔中旧液，洗2次，加入1.2%甲基纤维素/2%血清/MEM 营养液，5%CO 2，37℃孵箱培养至4d ，经0.2%结晶紫/10%甲醛染色，细胞单层上可见明显的空斑形成.空斑呈圆型，大小均匀，约1.5～2mm ，边缘光滑清晰，见图3．甲基纤维素蚀斑滴定重组痘苗病毒vTF7-3平均滴度为 1.54×109PFU/mL ．两种方法获得的病毒蚀斑滴度见表1．从表1中可看出，甲基纤维素方法中测定的病毒蚀斑滴度略高于琼脂法，但统计学分析结果显示两者无统计学意义（P ＞0.05）．覆盖层Titers （PFU/mL ）第1次第2次第3次平均值琼脂 1.44×109 1.16×109 1.17×109 1.27×109纤维素1.67×1091.45×1091.50×1091.54×1093讨论HeLa 细胞和M A104细胞均属痘苗病毒敏感细胞．vTF7-3重组痘苗病毒感染HeLa 细胞，出病变的时间比感染MA104细胞要晚，但病毒产量却较高．可能是HeLa 属肿瘤细胞，生长较快，密度较大的原因．但滴定vTF7-3重组痘苗病毒图2不同浓度的痘苗病毒感染MA104细胞后，覆盖琼脂营养层形成的蚀斑（94h 结果）abcfd e 图3MA104细胞单层感染痘苗病毒覆盖甲基纤维素92h后结果表1vTF7-3病毒感染MA104细胞加不同覆盖层的蚀斑滴定结果的感染性滴度（TCID50），用MA104细胞单层比用HeLa 细胞单层滴定的结果好观察，并且滴度明显较高．见表1．笔者多次试验的结果发现，vTF7-3重组痘苗病毒在M A104细胞上显示的蚀斑比在HeLa 细胞上易观察．原因还不太清楚，可能是HeLa 细胞重叠生长，病变时细胞同时皱缩．所以笔者选用M A104细胞检测vTF7-3重组痘苗病毒的蚀斑滴度.据有关文献报道，痘苗病毒为非释放型病毒，它增殖的子代病毒主要通过细胞间传播，不需要覆盖物便可在细胞上形成液体蚀斑[4]．在本试验中可观察到，M A104细胞单层感染重组痘苗病毒vTF7-324h 后48h 以前，早期细胞病变时，在显微镜下可看到有似空斑一样的病灶（即液体蚀斑）见图1b ．病毒稀释度越高，这种似空斑一样的病灶越清晰，因为病毒浓度低，形成的病灶不易相融，容易观察计数．这也说明在痘苗病毒的蚀斑滴定时，一个空斑的形成确由一个感染性病毒颗粒产生．但在HeLa 细胞上感染重组痘苗病毒后这种现象却观察不到，见图1B ．在做纤维素蚀斑法滴定的同时也做过不加覆盖物的蚀斑滴定，但出斑大小不均匀，对计数有影响．vTF7-3重组痘苗病毒感染MA104细胞后，第30卷昆明医学院学报4（下转第49页）张雅永，等．脂肪间质干细胞在心肌缺血性疾病中的应用49第3B 期sue into cardiomyocytes ［J ］．Ann Thorac Surg ，2003，75（3）：775－779.［11］GAUSTAD K G ，BOQUEST A C ，ANDERSON B E ，et al.Differentiation of human adipose tissue stem cells using extracts of rat cardiomyocytes ［J ］．Biochem 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