酶免疫技术
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3.再加入酶标记抗原，则结合为抗原抗体-酶标记抗原复合物。
4.酶催化底物并显色。
用特异性抗原进行包被和制备酶 结合物。此法中受检标本不需稀 释，可直接用于测定，因此其敏 感度相对高于间接法。
抗原的两个以上的位点， 因此不能用双抗体夹心法进行测定，可采用竞争法模式
HRP常用底物
邻苯二胺（OPD）:反应后显橙黄色，酸终止后 呈棕黄色,最大吸收峰275nm。灵敏度高，比色 方便。但配成应用液后稳定性差,显色过程需避 光，且有致变异性.
四甲基联苯胺（TMB）:反应后显蓝色，目测鲜 明，酸终止后呈黄色，最大吸收峰450nm.稳定 性好，显色过程无需避光，无致变异性.
碱性磷酸酶（AP）：是一种磷酸酯的水解 酶，不易透入细胞内，但因其敏感性高， 空白值低，也较常用。底物常用的有对-硝 基苯磷酸酯(PNP)，产物为黄色的硝基酚， 测定波长为405nm。
ß-半乳糖苷酶（ ß-Gal）：来源于大肠埃希 氏菌，不受内源性酶干扰，底物为4-甲基 伞形酮--D-半乳糖苷，产物为高强度荧光 物4-甲基伞形酮，敏感性较HRP者高30-50 倍，测量时需用荧光计。
酶标记物的制备
一般要求 •技术方法简单、标记效率高、重复性好 •标记反应易控制，标记后不改变活性 •酶标记物较稳定，不聚合
改良过碘酸钠标记法
•只适用于HRP •过碘酸钠将HRP分子表面的多糖羟基氧化为 醛基，醛基可与抗体蛋白的游离氨基结合
•形成HRP-CH2-NH-IgG复合物 •再用硼氢化钠还原（终止反应） •优点是产率高
均相酶免疫测定
固相酶免疫测定
异相酶免疫测定
（ELISA）
液相酶免疫测定
酶的选择要求：
•活性高 •专一性好 •易与抗原、抗体偶联 •底物易得、易保存无毒害 •产物易测量 •酶与底物成本价廉
常用的酶及底物----辣根过氧化物酶(HRP)
优点(与其他酶比较)主酶是糖蛋白(275nm)，无活性，
•分子量较小
戊二醛交联标记法
•以双功能交联剂戊二醛(活性醛基)为桥
• 一步法：简便易行，交联时反应物分子间 比例不易控制
•二步法：酶和抗体分步与戊二醛交联，先 用过量的戊二醛与酶作用，使戊二醛上的 活性醛基先与酶蛋白上的一个氨基结合， 再加入抗体反应。
•酶标记物质量较均一，标记效率较高
酶联免疫吸附试验
( enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)
（二）ELISA技术类型：
ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体， 在这种测定方法中有3种必要的试剂：
❖ 固相的抗原或抗体即"免疫吸附剂"（immunosorbent）
❖ 酶标记的抗原或抗体称为“结合物”（conjugate）
❖ 酶作用的底物。
酶联试剂
阳性对照
酶标记物
显色液 A
终止液
反应板
显色液 B
竞争法特点：
❖ 用于抗原和半抗原的定量测定，也可对抗体进行测定。 ❖ 酶标Ag（Ab）与样品或标准品中的非标记Ag（Ab）具有相同
的与固相Ab(Ag)结合的能力。 ❖ 反应体系中，固相Ab（Ag）和酶标Ag（Ab）是固定限量的，
辅基亚铁血红素(403nm)，有活性
•标记方法简单 •较稳定
纯度(RZ)=403nm/275nm >3.0
酶活性单位：1min将1umol底物转 化为产物所需的酶量
•溶解性好 HRP催化反应：DH2+H2O2 D+2H2O •价格较低 过氧化物(受氢体）：H2O2 •底物种类多 供氢体：OPD、TMB
※适用于分子中具有至少两个抗原决定簇的多价 抗原，而不能用于小分子半抗原的检测
※所用两种抗体分别针对同一个抗原分子的不同 抗原决定簇
2．间接法
间接法测抗体
酶
抗抗 体
酶标记 抗抗体
抗体
抗原 固相载体
1.将抗原包被在固相载体上。
2.如样品中含有抗体，则结合为抗原 抗体复合物。
3.再加入酶标记抗抗体（抗IgG）， 则结合为抗原-抗体-酶标记抗抗体复 合物。
浓缩洗涤液 加样枪与吸头
阴性对照
1．双抗体夹心法
双抗体夹心法测抗原 酶 酶标记抗体
抗体
抗原
1.将抗体包被在固相载体上。
2.如样品中含有抗原，则结合为抗 原抗体复合物。
3.再加入酶标记抗体，则结合为抗 体-抗原-酶标记抗体复合物。
4.酶催化底物并显色。
抗体 固相载体
双抗体夹心法特点： ※非竞争结合反应 ※常用于抗原的检测
酶免疫技术
标记免疫技术= 免疫技术+标记技术
抗原抗体反应 示踪物标记
特异性
标记免疫技术的主要特点：
高特异性、高灵敏性
灵敏性
标记免 疫技术
免疫组 化技术
免疫测 定技术
示踪物及 标记技术
酶免疫技术 荧光免疫技术 放射免疫技术 化学发光技术 金免疫技术 生物素-亲和素 免疫放大技术
……
酶免疫技术
基本原理
(一)基本原理：
❖ 使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持 其免疫活性（固相抗原／抗体的形成）
❖ 在测定时，把受检标本（测定其中的抗体或抗原） 和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面 的抗原或抗体起反应（抗原抗体反应）
※用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体 复合物与其他物质分开，最后结合在固相载体 上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。 （酶标抗原抗体复合物的分离） ※加入底物后，底物被酶催化变为有色产物， 产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故 可根据颜色反应的深浅进行定性或定量分析。 （显色反应）
利用酶催化底物反应的生物放大作用,提 高特异性抗原-抗体免疫学反应的检测敏感性 的一种标记免疫技术。
基本特点：
①标记后保留酶和抗原(抗体)的活性。 ②酶促反应专一性，保证特异性。 ③底物反应放大作用，提高敏感性。 ④酶标试剂保存稳定。 ⑤操作简便，安全易行。
酶免疫技术
酶免疫组化 酶免疫测定
用于检测组织切片或细胞涂片中的抗原和抗体
4.酶催化底物并显色。
间接法的优点是只要变换包被抗原就 可利用同一酶标抗抗体(酶标抗人IgG) 建立检测相应抗体的方法。易受血清 中高浓度非特异性IgG的干扰，待测 标本需稀释后测定。
3.双抗原夹心法测抗体 酶 酶标记
抗原 抗原
抗体
1.将抗原包被在固相载体上。
2.如样品中含有抗体，则结合为抗原 抗体复合物。
4.酶催化底物并显色。
用特异性抗原进行包被和制备酶 结合物。此法中受检标本不需稀 释，可直接用于测定，因此其敏 感度相对高于间接法。
抗原的两个以上的位点， 因此不能用双抗体夹心法进行测定，可采用竞争法模式
HRP常用底物
邻苯二胺（OPD）:反应后显橙黄色，酸终止后 呈棕黄色,最大吸收峰275nm。灵敏度高，比色 方便。但配成应用液后稳定性差,显色过程需避 光，且有致变异性.
四甲基联苯胺（TMB）:反应后显蓝色，目测鲜 明，酸终止后呈黄色，最大吸收峰450nm.稳定 性好，显色过程无需避光，无致变异性.
碱性磷酸酶（AP）：是一种磷酸酯的水解 酶，不易透入细胞内，但因其敏感性高， 空白值低，也较常用。底物常用的有对-硝 基苯磷酸酯(PNP)，产物为黄色的硝基酚， 测定波长为405nm。
ß-半乳糖苷酶（ ß-Gal）：来源于大肠埃希 氏菌，不受内源性酶干扰，底物为4-甲基 伞形酮--D-半乳糖苷，产物为高强度荧光 物4-甲基伞形酮，敏感性较HRP者高30-50 倍，测量时需用荧光计。
酶标记物的制备
一般要求 •技术方法简单、标记效率高、重复性好 •标记反应易控制，标记后不改变活性 •酶标记物较稳定，不聚合
改良过碘酸钠标记法
•只适用于HRP •过碘酸钠将HRP分子表面的多糖羟基氧化为 醛基，醛基可与抗体蛋白的游离氨基结合
•形成HRP-CH2-NH-IgG复合物 •再用硼氢化钠还原（终止反应） •优点是产率高
均相酶免疫测定
固相酶免疫测定
异相酶免疫测定
（ELISA）
液相酶免疫测定
酶的选择要求：
•活性高 •专一性好 •易与抗原、抗体偶联 •底物易得、易保存无毒害 •产物易测量 •酶与底物成本价廉
常用的酶及底物----辣根过氧化物酶(HRP)
优点(与其他酶比较)主酶是糖蛋白(275nm)，无活性，
•分子量较小
戊二醛交联标记法
•以双功能交联剂戊二醛(活性醛基)为桥
• 一步法：简便易行，交联时反应物分子间 比例不易控制
•二步法：酶和抗体分步与戊二醛交联，先 用过量的戊二醛与酶作用，使戊二醛上的 活性醛基先与酶蛋白上的一个氨基结合， 再加入抗体反应。
•酶标记物质量较均一，标记效率较高
酶联免疫吸附试验
( enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)
（二）ELISA技术类型：
ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体， 在这种测定方法中有3种必要的试剂：
❖ 固相的抗原或抗体即"免疫吸附剂"（immunosorbent）
❖ 酶标记的抗原或抗体称为“结合物”（conjugate）
❖ 酶作用的底物。
酶联试剂
阳性对照
酶标记物
显色液 A
终止液
反应板
显色液 B
竞争法特点：
❖ 用于抗原和半抗原的定量测定，也可对抗体进行测定。 ❖ 酶标Ag（Ab）与样品或标准品中的非标记Ag（Ab）具有相同
的与固相Ab(Ag)结合的能力。 ❖ 反应体系中，固相Ab（Ag）和酶标Ag（Ab）是固定限量的，
辅基亚铁血红素(403nm)，有活性
•标记方法简单 •较稳定
纯度(RZ)=403nm/275nm >3.0
酶活性单位：1min将1umol底物转 化为产物所需的酶量
•溶解性好 HRP催化反应：DH2+H2O2 D+2H2O •价格较低 过氧化物(受氢体）：H2O2 •底物种类多 供氢体：OPD、TMB
※适用于分子中具有至少两个抗原决定簇的多价 抗原，而不能用于小分子半抗原的检测
※所用两种抗体分别针对同一个抗原分子的不同 抗原决定簇
2．间接法
间接法测抗体
酶
抗抗 体
酶标记 抗抗体
抗体
抗原 固相载体
1.将抗原包被在固相载体上。
2.如样品中含有抗体，则结合为抗原 抗体复合物。
3.再加入酶标记抗抗体（抗IgG）， 则结合为抗原-抗体-酶标记抗抗体复 合物。
浓缩洗涤液 加样枪与吸头
阴性对照
1．双抗体夹心法
双抗体夹心法测抗原 酶 酶标记抗体
抗体
抗原
1.将抗体包被在固相载体上。
2.如样品中含有抗原，则结合为抗 原抗体复合物。
3.再加入酶标记抗体，则结合为抗 体-抗原-酶标记抗体复合物。
4.酶催化底物并显色。
抗体 固相载体
双抗体夹心法特点： ※非竞争结合反应 ※常用于抗原的检测
酶免疫技术
标记免疫技术= 免疫技术+标记技术
抗原抗体反应 示踪物标记
特异性
标记免疫技术的主要特点：
高特异性、高灵敏性
灵敏性
标记免 疫技术
免疫组 化技术
免疫测 定技术
示踪物及 标记技术
酶免疫技术 荧光免疫技术 放射免疫技术 化学发光技术 金免疫技术 生物素-亲和素 免疫放大技术
……
酶免疫技术
基本原理
(一)基本原理：
❖ 使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持 其免疫活性（固相抗原／抗体的形成）
❖ 在测定时，把受检标本（测定其中的抗体或抗原） 和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面 的抗原或抗体起反应（抗原抗体反应）
※用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体 复合物与其他物质分开，最后结合在固相载体 上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。 （酶标抗原抗体复合物的分离） ※加入底物后，底物被酶催化变为有色产物， 产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故 可根据颜色反应的深浅进行定性或定量分析。 （显色反应）
利用酶催化底物反应的生物放大作用,提 高特异性抗原-抗体免疫学反应的检测敏感性 的一种标记免疫技术。
基本特点：
①标记后保留酶和抗原(抗体)的活性。 ②酶促反应专一性，保证特异性。 ③底物反应放大作用，提高敏感性。 ④酶标试剂保存稳定。 ⑤操作简便，安全易行。
酶免疫技术
酶免疫组化 酶免疫测定
用于检测组织切片或细胞涂片中的抗原和抗体
4.酶催化底物并显色。
间接法的优点是只要变换包被抗原就 可利用同一酶标抗抗体(酶标抗人IgG) 建立检测相应抗体的方法。易受血清 中高浓度非特异性IgG的干扰，待测 标本需稀释后测定。
3.双抗原夹心法测抗体 酶 酶标记
抗原 抗原
抗体
1.将抗原包被在固相载体上。
2.如样品中含有抗体，则结合为抗原 抗体复合物。