乳腺上皮细胞分离方法

奶山羊乳腺上皮细胞的分离、培养与鉴定
一、乳腺组织的采取及处理
从屠宰场切取无乳腺疾病的泌乳后期奶山羊乳腺组织，置冰盒内运回实验室，清洗消毒后，无菌操作剥开深层乳腺组织，取约5g的腺泡组织，放入PBS 液中依次漂洗5次，洗净乳汁和血液，然后将其剪切成1mm3左右的小块，用PBS液充分冲洗吹打后，静置30s，弃去上清液及少量漂浮的脂肪组织，反复多次，至上清液不混浊时即可。

（杨雪峰）
二、山羊乳腺上皮细胞原代培养
（1）酶消化法
方法一：I 型胶原酶结合透明质酸酶消化法
a.酶消化
用含150 U /m L的I 型胶原酶和100 U /mL的透明质酸酶的混合液, 37 ℃消化组织块4h , 可得到大量的分散单细胞用于原代培养，收集细胞及细胞团块。

根据密度大小接种于6孔培养板,置于5 % CO2饱和湿度的细胞培养箱中培养, 次日换液，以后隔日换液（曹艳红）。

b.纯化
用专用消化液消化回收乳腺上皮细胞与成纤维细胞的混合物。

将细胞悬液以适宜浓度接种于培养瓶,在37℃、5% CO2和饱和湿度下静置培养。

待培养瓶基本铺满单层细胞时,先加成纤维细胞消化液,37℃消化,待成纤维细胞脱离瓶壁时,将酶液倾出。

然后加入专用消化液继续消化,待上皮细胞回缩并脱离皿底后终止消化。

细胞悬液离心浓缩后收集的细胞绝大多数为上皮细胞,继续传代培养并分离纯化,当得到乳腺上皮细胞纯细胞系时,终止纯化。

方法二（先用哪种酶消化？）：
组织块剪成1mm3，置于酶消化液中（Ⅱ型胶原酶消化3.5h，0.25%胰蛋白酶消化时每隔30min收集一次细胞），37℃水浴消化后取出，用200目的滤网过滤，再1000r/min离心10min，去掉上清液，再加入培养液，吹打均匀后细胞计数接种，接种数为106/ml。

（陈秋菊）
方法三：胶原酶Ⅱ消化法
将组织小块剪切成糊状后，加入５倍体积的Ⅱ型胶原酶溶液，37℃消化2h，约20min摇动1次，使其充分消化。

然后用孔径75μm（200目）尼龙网过滤消化液，滤液于1500r/min离心5min，去除上清液，底部沉淀中加入细胞培养液，制成细胞悬液，细胞计数后，按5×105ml-1的细胞密度接种于培养瓶内，置于37℃、体积分数5%CO2培养箱中培养。

48h后，更换培养液，用倒置相差微镜观察，待细胞长至瓶底壁面积的80~90%时，消化传代。

（杨雪峰）
（2）组织块贴壁培养法
方法一
将腺泡组织剪成1mm3的组织块；用PBS 缓冲液清洗组织块3次；将组织块按照一定间距转入培养瓶内；静置30 min（使组织块更好的贴壁）；每瓶加入新鲜培养液2.0 m L（缓慢，防止组织块浮起），塞好瓶塞置37 ℃、5%CO2和饱和湿度的培养箱内培养；根据培养液的颜色变化更换培养液（每天进行细胞形态观测，细胞计数，测上清液p H）（宁维）
方法二：
①制备鼠尾胶原蛋白
鼠尾胶原制备和培养皿的处理：取成年大白鼠鼠尾3支,从尾根部切断鼠尾,置75%酒精中30 min,无菌条件下将其切成1.5 cm小段,剔除皮毛,抽出尾腱置平皿中,剪碎,取1.5 g浸入150 ml 0.1 M酸醋溶液,置4℃冰箱中,并不时摇动,48 h后移入离心管,以4000 rpm离心30 min,取上清液,高压灭菌10 min后分装入小瓶中,-20℃冰箱保存。

取少量鼠尾胶原铺满培养皿底壁,紫外线照射30 min,备用在杨雪峰等的实验中，培养瓶和培养皿虽未经鼠尾胶原或胶原蛋白包被，但也未见对奶山羊乳腺上皮细胞原代和传代培养有显著影响。

②细胞原代培养
用眼科镊子将修剪好的乳腺组织块移入铺胶原的培养皿及未铺胶原的对照皿中，使组织块均匀分布,间距0.5cm左右。

轻轻翻转培养皿,倒置于37℃,5% CO2培养箱中10～15 min,使组织块微干涸,贴牢皿底。

加入培养液,使其略高于组织块。

静置于37℃,5% CO2培养箱中培养。

每3d观察并换液1次。

第7天起每日观察1次并根据细胞生长状况换液待细胞基本铺满培养皿底壁,吸出培养液,D- Hank's 洗涤2次,加入少量消化液(D- Hank's液添加0.15%胰蛋白酶,0.02%EDTA),37℃消化,镜下观察,待细胞回缩,细胞间隙增大,部分细胞脱离皿底后,立即加培养液终止消化。

轻轻吹打,制成细胞悬液,稀释,细胞接种其他培养皿中继续培养。

（高亚军）（3）旋转培养法
将组织剪成约 1 mm3的组织块；用PBS缓冲液清洗组织块3次；将组织块按照一定间距转入培养瓶内；轻轻将培养瓶翻转过来，将适量培养液加到非细胞生长面上，注意翻瓶时勿令组织小块流动，塞好瓶塞置36.5 ℃恒温箱培养 2 h（勿超过4 h），使小块微干涸；从恒温箱中取出培养瓶，开塞，46°斜持培养瓶，箱瓶底脚部轻轻注入培养液，然后缓缓再把培养瓶翻转过来，让培养液慢慢覆盖附于瓶底上的组织小块，置恒温箱中静止培养，待细胞从组织块游出量增后，再补加培养液。

（宁维）
（4）胶原酶Ⅱ消化法配合组织块贴壁法
先用酶消化后，用PBS冲掉酶液，在进行贴壁培养。

该方法不能获得正常生长的乳腺上皮细胞（陈秋菊）
（5）组织块再移法
待组织块长出的细胞铺满皿底70%时，将其移出到另一个直径为60mm的培养皿，放置在37℃、5%CO2和饱和湿度的培养箱中2h，取出加入1.5ml左右的培养液继续培养，第二天再加1ml培养液，适时换液。

（6）其他
获得乳腺实质组织，剪成小块，贴壁培养，当细胞铺满培养皿时，加入专用消化液回收乳腺上皮细胞和成纤维细胞的混合物。

将混合物接入培养皿中，置于37℃、5%CO2和饱和湿度的培养箱中培养，待细胞铺满后，加入成纤维细胞消化液37℃消化，倒出酶液。

再加入专用消化液，待乳腺上皮细胞脱离瓶底后停止消化。

离心浓缩，分离纯化，得到乳腺上皮细胞纯细胞系。

二、传代培养
首次传代时,先吹打洗涤细胞,吸掉全部培养液,加少量胰酶,以刚好覆盖细胞为宜,吸掉,重复2次,第3次加酶后,在室温下消化5 min,镜下观察,发现细胞质回缩,细胞间隙增大后,加培养液终止消化。

反复吹打制成细胞悬液,计数,细胞接种于24孔培养板中,每孔5×104个细胞,加培养液1 mL,置37℃50 mL/L CO2培养箱中培养。

三、纯化
待细胞长至培养瓶底壁面积的８０％～９０％时，吸弃培养液，用ＰＢＳ漂洗２次，加入适量胰酶消化液，置于３７℃培养箱内消化，并在倒置显微镜下观察。

当发现纤维样细胞回缩、变圆，细胞间隙扩大且大部分脱壁时，立即倒掉胰酶消化液，用ＰＢＳ冲洗２次，再加入适量胰酶消化液，继续消化未脱壁细胞。

待细胞９０％左右脱壁时，立即加入含血清的培养基终止消化。

用弯头吸管吸取瓶内培养液，反复吹打瓶壁细胞，使其脱壁，然后将形成的细胞液于１５００ｒ／ｍｉｎ离心５ｍｉｎ，去除上清液。

底部细胞中加入细胞培养液，重新制成细胞悬液，并接种于培养瓶内，静置２０～３０ｍｉｎ。

在显微镜下观察，当有部分细胞贴壁、稍加振荡也不浮起时，将培养液连同尚未贴壁的细胞一起倒掉。

加入新鲜培养液，调整好细胞密度，继续培养。

重复上述操作１～３次，继续培养，逐日观察。

四、鉴定
(1)免疫组化法
待纯化的细胞铺满皿底后，用95乙醇/1%冰醋酸组成的固定液将其固定10min，分别用Cytokeratin和Vimentin做一抗，按S-P免疫组化染色试剂盒说明进行免疫组化染色，随后用DAB显色液进行显色，显微镜下观察。

细胞质呈深棕色的为阳性细胞，未着色者为阴性细胞。

（富国文2007）
(2)免疫荧光细胞染色法
将细胞接种到24孔板中，分别进行角蛋白、波形蛋白、上皮膜抗原、β-酪蛋白免疫荧光染色，具体方法参照试剂盒说明书，操作完成后用Hoechst33342染核，一抗为单克隆鼠抗羊角蛋白抗体、单克隆鼠抗波形蛋白抗体、单克隆兔抗人上皮膜抗原抗体、单克隆兔抗羊β-酪蛋白抗体，二抗为羊抗小鼠IgG，羊抗兔IgG。

（王祯）
(3)透射电镜观察
取传代培养到第6代、第7代的对数期生长细胞，用TE消化后收集细胞用4℃预冷的含3%戊二醛的0.1mol/L PBS（pH7.3）固定，超薄切片后进行常规透射电镜观察。

（李向臣）
(4)油红染色
在35 mm 皿接种适量细胞，培养至第8 天进行油红染色。

方法如下：10％福尔马林预固定、40％福尔马林固定 1 h 以上，用超纯水、60％异丙醇漂洗。

干燥后加入1 ml油红染液室温孵育15 min，超纯水洗数次，最后用Hoechst33342 染核，在倒置荧光显微镜下观察。

(5)检测山羊酪蛋白
方法一：
①山羊酪蛋白血清的制备
标准山羊酪蛋白用生理盐水稀释到4mg/ml，与弗氏佐剂等体积混合制成油包水型佐剂。

首先每只兔子腋下肌注1ml弗氏完全佐剂，10天后，皮下多点注射首次免疫，每只兔子2mg标准山羊酪蛋白。

10天后采用弗氏不完全佐剂加强免疫，计量加倍。

连续4次免疫后采血，达到效价要求后分离血清。

②乳腺上皮细胞表达蛋白质的检测
以制备的兔抗山羊酪蛋白血清作为标准抗体，以标准山羊酪蛋白为标准抗原，将山羊乳腺上皮细胞上清液及细胞裂解液作为待检抗原，用免疫琼脂双扩散法检测乳腺上皮细胞上清液和细胞裂解液中是否有酪蛋白。

（任芳丽）
方法二：细胞表达产物电泳分析
收集细胞培养第七天上清液作为样品，标准山羊酪蛋白为标准对照，细胞培养液为空白对照，标准分子量为Marker，按电泳技术常规操作。

（欧阳五庆）方法三：细胞表达产物印记分析
一抗为兔抗山羊酪蛋白抗体，二抗为碱性磷酸酶标记的山羊抗兔IgG抗体，按印记分析技术规范操作。

方法四：RT-PCR检测β-酪蛋白
Trizol 法提取细胞总RNA，反转录为cDNA 后进行PCR 扩增(扩增长度300 bp)。

上游引物：5′-ACAGCCTCCCACAAAACATCC-3′；下游引物：5′-TGAGAAAGGGACAGCACGGA-3′。

扩增条件如下：95℃4 min；94℃30 s，55℃30 s，72℃30 s，30 个循环；72℃10 min。

产物进行1％琼脂糖凝胶，电泳检测。

Ⅰ型胶原酶消化的是内皮细胞，Ⅱ型胶原酶消化的是成纤维细胞。