抗原特异性免疫应答和免疫耐受的分子机制及其应用基础研究

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项目名称：抗原特异性免疫应答和免疫耐受的分子

机制及其应用基础研究

首席科学家：曹雪涛第二军医大学免疫学研究所起止年限：2004年6月至 2006年8月

依托部门：总后卫生部国家自然科学基金委员会

一、研究内容和课题设置

1.项目计划任务书原定内容

2.后三年调整方案

根据预期目标，本项目仍然设置九个课题，具体内容作适当调整，调整如下：课题一、抗原特性与免疫应答关系的研究：

一、多方面的研究提示治疗性疫苗在研制策略、分子结构、作用机理、给药方式等方面与预防性疫苗截然不同。治疗性疫苗需在体诱导Th1极化和CTL反应，这在细胞内感染和肿瘤尤为重要，但可溶性蛋白难以在体诱导CTL反应。在体液免疫有中和性抗体（保护性抗体）和非中和性抗体之分，诱导产生中和性抗体是预防性疫苗的基本技术要求；而在细胞免疫，已表明不同表位特异性的CTL克隆在清除病原（抗原）和损害靶细胞功能方面有所不同。确定CTL的分类和保护性是治疗性疫苗设计的基础。天然蛋白凭其“不合理的”表位组分引发免疫颠覆（immune subvertion）和免疫偏移（immune deviation），进而引起免疫耐受、免疫缺陷而造成感染持续状态。持续感染状态下患者对天然抗原往往处于耐受状态。欲克服免疫耐受状态不宜采用天然抗原。如何利用有益的表位组分、避开病理性表位组分，有效在体诱导Th1极化和CTL 应答成为治疗性疫苗研究的关键技术问题。

针对上述问题，本研究拟在以往研究基础上进一步开展如下研究：

8瞄准不同表位特异性CTL在清除病原（抗原）和损伤靶细胞上的作用不同，提出了存在保护性（中和性）CTL和非保护性CTL的假设，在乙肝病毒的已有研究初步证实验证了此假说，不同表位的CTL应答与乙型肝炎的转归存在相关性，我们拟进一步在肿瘤模型中验证。并基于实验发现，修正完善业已提出的“蛋白质抗原免疫识别的氨基酸密码学说”。

9针对慢性持续感染状态和肿瘤情况下，宿主处于对天然抗原免疫耐受，我们提出了“抗原工程”（英文应名为：antigen engineering）、“模拟抗原”（英文应名为：mimogen）、“模拟病毒（英文应名为：mimovirus）的概念和思路，它应启动与天然抗原相同的特异性、而克服了天然抗原耐受的细胞免疫应答。我们已经以乙型肝炎病毒或肿瘤为模型设计、筛选系列模拟抗原和模拟病毒，并发现一些抗原结构可有效克服慢性持续感染状态和肿瘤情况的天然抗原耐受。在此基础我们拟

进一步探讨此类抗原结构引起不同免疫应答识别和呈递的机理。

10拟在业已提出的基于表位的治疗性疫苗研制技术路线（英文译名为：epitope-based vaccine design,EBVD）框架基础上，以分子设计、MHC I 类分子呈递途径靶向、肝脏靶向、APC靶向和模拟病毒（英文应名为：mimovirus）等技术为基础，以乙型肝炎治疗性疫苗或肿瘤为模型，在高分辩率表位图谱的基础上，围绕“氨基酸如何构建表位、表位如何构建免疫原”两个基本问题进行探讨，建立基于表位的治疗性疫苗研究技术路线，探讨在体启动Th1极化和CTL反应的有效技术方法。

二、生物在进化演变过程中，不同物种间的同一基因常常表现出一定程度的同源性，这是生物基因组的特征之一。我们设想利用种与种之间的同源蛋白、肽段或基因进行免疫治疗或免疫基因治疗，可能会诱导强烈的免疫反应，克服自身免疫耐受，我们利用这一原理在肿瘤免疫基因治疗方面已进行了一些初步的探索。我们拟利用这一原理继续对胚胎免疫排斥的分子机理进行探讨，同时为同种异体器官免疫排斥、自身免疫性疾病的治疗提供理论依据。

1. 异种同

2. 源基因免疫及其诱导胚胎免疫排斥分子机理研究

我们初步实验已发现使用异种绒毛膜细胞免疫小鼠，可以阻止小鼠的受孕或诱导流产，并且发现是涉及交叉免疫反应，以及过继免疫输注血清有阻止小鼠的受孕或诱导流产。Western blot可见免疫血清认识多个分子。本研究希望继续鉴定这些分子，对生殖免疫学有重要的意义，主要进行以下有关研究内容：

2)利用异种绒毛膜细胞免疫小鼠获得的免疫血清筛选绒毛膜细胞cDNA表达

文库，克隆绒毛膜细胞上与胚胎发生有关的重要分子。

3)直接利用蛋白质组技术鉴定相关的免疫血清认识多个分子。

4)用新克隆的异种基因构建异种基因、蛋白/肽疫苗，观察其抗生殖免疫效应，

分析其分子机理。

3. 异种同

4. 源基因免疫及其抗同

5. 种异体器官免疫排斥分子机理研究

使用异种（如大鼠、鱼类或蛙类等）的CD40－CD40L、OX40－OXL、

CD28-B7-1/B7-2, CTLA4-B7-1/B7-2等进行免疫或免疫基因治疗，诱导相应的抗体，阻断这些分子的作用，观察其在动物模型中抗同种异体器官免疫排斥作用。

6. 异种同

7. 源基因免疫及其抗自身免疫性疾病分子机理研究

肝硬化及自身免疫性疾病等发生发展中，一些细胞因子及受体起着重要的作用。如能诱导针对与肝硬化、系统性红斑狼疮及类风湿性关节炎等有关的一些细胞因子或受体进行异种同源基因免疫，可能产生一些自身阻断抗体阻断这些细胞因子或受体的作用，从而阻断疾病的进展。

4)使用异种（如鱼类或蛙类）的CD40配体及B淋巴细胞刺激因子（BLyS）或

受体进行免疫，诱导抗CD40配体或BLyS或受体的抗体，阻断CD40或BLyS

的作用，观察其在动物模型抗系统性红斑狼疮及抗类风湿性关节炎等的作

用；

5)使用异种VEGF、TGF-beta、TNF-alpha、bFGF或其受体进行免疫，观察其

阻断动物型肝硬化及抗类风湿性关节炎等中的作用及探讨其免疫学分子机

理。

三、根据我们在HBV引起的肝癌组织中发现的HBV抗原特异肽和热休克蛋白gp96的复合物，为了进一步深入研究此复合物的抗原特异性免疫应答的机制，拟开展下列研究：

1．人gp96氨基端肽结合域不同2．片段DNA克隆的构建及其表达和纯化，3．目标4．是获得对HBV等病毒抗原具有最佳的免疫佐剂作用的片段。

5．多种HLA型抗原肽的融合表达极其免疫活性的测定。目标6．是获得对多种HLA型具有免疫活性的抗原。

7．人gp96氨基端片段和不同8．HBV抗原肽或抗原蛋白刺激DC细胞成熟，9．并进一步研究能否引起naïve T 淋巴细胞扩增及免疫耐受的HBV患者体内特异的CTL扩增。目标10．是通过DC的研究为疫苗的开发提供启示。