土壤中分解尿素的细菌的分离和计数 PPT课件

实践训练
1.对细菌群体生长规律测定的正确的表述是（ A ）
A.在液体培养基上进行 B.至少接种一种细菌
C.接种一个细菌
D.及时补充消耗的营养物质
2.使用选择培养基的目的是（ C ）
A.培养细菌
B.培养真菌
C.使需要的微生物大量繁殖
D.表现某微生物的特定性状与其他微生物加以区别
3.能合成脲酶的微生物所需要的碳源和氮源分别是
⑴青霉素发酵产生青霉素。青霉菌的新陈代谢类型 是 异养需氧型 ，青霉素是青霉菌的 次级 代谢产物。
⑵在生产和科研中，常选用处于 对数 期的青霉菌作 为菌种或研究材料，因为此时的青霉菌代谢旺盛， 和 个体的形态 生理特性 比较稳定。
⑶对青霉菌菌体生长情况的测定：取一定体积的发 酵液，经离心分离、反复洗涤 后， 称菌体的湿重 （称烘干后的重量） ，再计算发酵罐 中菌体的总重量。
( D)
A.CO2和N2 C.CO2和尿素
B.葡萄糖和NH3 D.葡萄糖和尿素
4.下列说法不正确的是（ B ）
A.科学家从70－80度热泉中分离到耐高温的TaqDNA聚 合酶
B.统计某一稀释度的5个平板的菌落数依次为M1、M2、 M3、M4、M5，以M3作为该样品菌落数的估计值
C.设置对照实验的主要目的是排除实验组中非测试因 素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度
大肠杆菌在伊红美蓝琼脂(EMB)上典型特征 大肠杆菌呈 黑色中心 ,有或无金属光泽
本课题知识小结:
六、例题解析
答案：A
例1．对细菌群体生长规律测定的正确的表述是 A．在液体培养基上进行 B．至少接种一种细菌 C．接种一个细菌 D．及时补充消耗的营养物质
解析：细菌群体生长规律的测定是人们在一定条件下进行的。 这些条件是：一种细菌、恒定容积的培养基，液体培养基、定时 测定细菌总数。在这些条件下，才能测定出细菌的生长规律。测 定时只能用一种细菌的子细胞群体的变化规律表达微生物的生长； 恒定容积是给微生物提供一定的生存环境；液体培养基才能通过 样品推测细菌总数。若接种多种细菌，则会发生种间斗争而不能 测定一种微生物的生长规律。在接种时，要保证一定的接种量。
面生长的一个菌落，来源于样品稀释 液中的一个活菌，通过统计平板上的 菌落数，就能推测出样品中大约含有 多少活菌。
每克样品中的菌落数＝(C÷V)×M
其中，C代表某一稀释度下平板上生长的平 均菌落数，V代表涂布平板时所用的稀释液 的体积(ml)，M代表稀释倍数。
注意事项
①为了保证结果准确，一般选择菌落数在30— —300的平板上进行计数。
4、课题目的 ①从土壤中分离出能够分解尿素的细菌 ②统计每克土壤样品中究竟含有多少这样的细菌
一.研究思路 ㈠.筛选菌株
㈡.统计菌落数目 ㈢.设置对照
㈠.筛选菌株
1、实例： DNA多聚酶链式反应是 一种在体外将少量DNA 大量复制的技术，此项 技术要求使用耐高温 （930C）的DNA聚合酶。
原因：因为热泉温度70～800C，淘汰了绝大 多数微生物只有Taq细菌被筛选出来。 启示：寻找目的菌种时要根据它对生存环境的 要求，到相应的环境中去寻找。
㈡.统计菌落数目：
1、显微镜直接计数：
利用血球计数板，在显微镜下计算一定容积里 样品中微生物的数量。
缺点
不能区分死菌与活菌； 不适于对运动细菌的计数； 需要相对高的细菌浓度； 个体小的细菌在显微镜下难以观察；
2.间接计数法（活菌计数法） （1）常用方法：稀释涂布平板法。
（2）原理：当样品的稀释度足够高时，培养基表
一、课题背景
1、ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ素的利用
尿素是一种重要的农业氮肥。 尿素不能直接被农作物吸收。 土壤中的细菌将尿素分解成氨之后才能被植物利 用。
2、细菌利用尿素的原因
土壤中的细菌分解尿素是因为它们能合成脲酶
脲酶
CO(NH2)2 +H2O
NH3 + CO2
3、常见的分解尿素的微生物
芽孢杆菌、小球菌、假单胞杆菌、克氏杆菌、 棒状杆菌、梭状芽孢杆菌，某些真菌和放线菌 也能分解尿素。
②为使结果接近真实值可将同一稀释度加到三 个或三个以上的平皿中，经涂布，培养计算出 菌落平均数。
③统计的菌落往往比活菌的实际数目低。
④涂布平板法所选择的稀释度很重要，一般以 三个稀释度中的第二个稀释度所出现的平均菌 落数在50个左右为最好。
㈢.设置对照：
设置对照的主要目的是排除实验组中非测试因素 对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。
2、实验室中微生物的筛选原理：
人为提供有利于目的菌株生长的条件(包括营 养、温度、pH等)，同时抑制或阻止其他微生 物生长。
要分离一种微生物，必须根据该微生物的特点，包 括营养、生理、生长条件等；配置合适的培养基 方法： ⑴抑制大多数微生物生长 ⑵造成有利于该菌生长的环境， 结果：培养一定时间后，该菌数量上升，再通过稀 释涂布平板法等方法对它进行纯化培养分离。
二.实验的具体操作
㈠.土壤取样
从肥沃、湿润的土壤中取样。先铲去表层 土3cm左右，再取样，将样品装入事先准备好的 信封中。 ◆取土样用的小铁铲和盛土样的的信封在使用 前都要灭菌。
㈡.制备培养基： 制备以尿素为唯一氮源的选择培养基。
[三]样品的稀释
◆应在火焰旁称取土壤10g。 ◆在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁进行
方案一：由其他同学用与A同学相同土样进行实验 结果预测：如果结果与A同学一致，则证明A无误； 如果结果不同，则证明A同学存在操作失误或培养 基的配制有问题。
方案二：将A同学配制的培养基在不加土样的情 况下进行培养，作为空白对照，以证明培养基是 否受到污染。
小结：通过这个事例可以看出，实验结果要有 说服力，对照的设置是必不可少的。
四、操作提示
无菌操作 做好标记 规划时间
五.课外延伸
在以尿素为唯一氮源的培养基中加入 酚红指示剂。培养某种细菌后，如果PH 升高，指示剂将变红，说明该细菌能够 分解尿素。
测定饮水中大肠杆菌数量的方法是将一定体积的水 用细菌过滤器过滤后，将滤膜放到 伊红美蓝 培养 基上培养，大肠杆菌菌落呈现黑色，通过记述得出 水样中大肠杆菌的数量。
结论：为获得不同类型的微生物，就需要按不
同的稀释度进行分离，同时还应当有针对性地 提供选择培养的条件。
㈣.取样涂布
◆实验时要 对培养皿作 好标记。注 明培养基类 型、培养时 间、稀释度、 培养物等。
◆如果得到了2个或2个以上菌落数目在30——300的平板， 则说明稀释操作比较成功，并能够进行菌落的计数，如 果同一稀释倍数的三个重复的菌落数相差较大，表明试 验不精确，需要重新实验。
3、土壤中分解尿素的细菌的分离与计数所需培养基：
KH2PO4 NaH2PO4 MgSO4`7H2O
葡萄糖
1.4g 2.1g 0.2g 10.0g
尿素
1.0g
琼脂
15.0g
①从物理性质看此培养基属于哪类？从功能上属
于哪类培养基？
固体培养基 选择培养基
②在此培养基中哪些作为碳源、氮源？
碳源：葡萄糖、尿素 氮源：尿素
D.同其他生物环境相比，土壤中的微生物数量最大， 种类最多。
5.为培养和分离出酵母菌并淘汰杂菌，常在培养基中
加入（C ）
A.较多的氮源物质
B.较多的碳源物质
C.青霉素类药物
D.高浓度食盐
例3．（2005年江苏）抗生素作为治疗细菌感 染的药物，其高效性和巨大的经济价值使抗生素工业 经久不衰。其中青霉素的发现和应用具有划时代的意 义。
4、培养基选择分解尿素的微生物的原理
培养基的氮源为尿素，只有能合成脲酶的微生物 才能分解尿素，以尿素作为氮源。缺乏脲酶的微 生物由于不能分解尿素，缺乏氮源而不能生长发 育繁殖，而受到抑制，所以用此培养基就能够选 择出分解尿素的微生物。
选择培养基：在微生物学中，将允
许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻 止其他种类微生物生长的培养基。
三.结果分析与评价
1.通过对照实验，若培养物有杂菌污染， 菌落数偏高；若培养物混入其他氮源，则 菌落形态多样，菌落数偏高，难以选择出 分解尿素的微生物。
2.提示：选择每个平板上长有30—300个 菌落的稀释倍计算每克样品的菌数最合适。 同一稀释倍数的三个重复的菌落数不能相 差悬殊，如相差较大，表示实验不精确。
㈤.微生物的培养与观察
培养不同微生物往往需要不同培养温度。 细菌：30～37℃培养1～2d 放线菌：25～28℃培养5～7d 霉菌：25～28℃的温度下培养3～4d。
在菌落计数时，每隔24h统计一次菌落数目。 选取菌落数目稳定时的记录作为结果，以防止 因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目。
微生物的培养与观察
设置对照的方法：
空白对照：不给对照组任何处理因素。
条件对照：给对照组施以部分实验因素，但不是所要研究的 处理因素。 自身对照：对照组和实验组都在同一研究对象上进行。 相互对照：不单设对照组，而是几个实验组相互对照。
A同学的结果与其他同学不同，可能 的解释有两种。 一是由于土样不同；
二是由于培养基污染或操作失误。
例2．在微生物群体生长规律的测定中，种内
斗争最显著最激烈的时期是
A．调整期
B．对数期
答案：C
C．稳定期
D．衰亡期
解析：种内斗争是一种生态因素。种内斗争反应了种内生物 对生存空间和生活资源的争夺。在生活空间充裕，营养充足的时 候，种内斗争的程度是比较低的。随着微生物个体数目的增加， 每个个体的生存空间越来越少，营养物质也越来越少，每个个体 对生存空间和资源的争夺也越来越激烈，种内斗争就越来越激烈。 由此可知，在稳定期的种内斗争最激烈。在衰亡期，微生物的数 目已经开始减少，pH已经极度不适于微生物的生存，次级代谢产 物积累到很高的程度，这时的微生物的生存斗争主要是与无机环 境的斗争。
◆分离不同的微生物采用不同的稀释度 原因：不同微生物在土壤中含量不同 目的：保证获得菌落数在30～300之间、适于计数 的平板
为什么分离不同的微生物要采用不同的稀释度？ 测定土壤中细菌的总量和测定土壤中能分解尿素 的细菌的数量，选用的稀释范围相同吗？
原因：土壤中各类微生物的数量（单位：株/kg）
是不同的。例如在干旱土壤中的上层样本中： 好氧及兼性厌氧细菌数约为2 185万，放线菌数 约为477万，霉菌数约为23.1万。