荧光分析法

ECl 0.05时，F 2.3K`I0ECl KC
关于灵敏度的问题
I A lg Ecl I0
紫外可见: 10-5
荧光: 10-7
F Kc
二、定量分析方法
1、标准曲线法
Fs－F0
• • •
Fx－F0
•
•
cx
cs
二、定量分析方法
2、比例法（对照法）
Fs F0 KCs
（2）激发态分子返回基态不
同振动能级
（3）激发态分子与溶剂分子
的相互作用
荧光光谱的特征
3、荧光光谱与激发光谱的镜像关系
产生原因：
电子基态的振动能级 分布与激发态的相似
例题
下列说法哪个是错误的？ A 荧光光谱的形状与激发波长无关
B 荧光波长总是大于激发光波长
C 荧光光谱的最短波长和激发光谱的最长波长
2 温度对荧光的影响
荧光素钠的乙醇溶液在下列哪种条件下荧光强度最强？
A 0℃
B -10 0℃
C -20 0℃
D -30 0℃
1. 一般情况下，随着温度的升高，溶液中荧光物
质的荧光效率和荧光强度将降低。
2. 原因: 温度升高时，分子运动速度加快，分子
间碰撞几率增加， 使无辐射跃迁增加， 从而降低
了荧光效率
C 能量大的光线
D 频率高的光线
（二）激发光谱和发射光谱
1. 激发光谱：excitation spectrum 表示不同激发波长的辐射引起物质发射某一 波长荧光的相对效率。 F –λex 2. 发射光谱：fluorescence/emission spectrum 表示在所发射的荧光中各种波长组分的相对强度。
－COOH、 －NO2、 －C＝O、－NO、卤素 荧光效率减弱甚至熄灭
与电子体系相互作用较小的取代基
例题
关于荧光效率，下面错误的叙述是： A 具有长共轭的ππ*跃迁的物质具有较大的荧光
效率
B 分子的刚性和共平面性越大，荧光效率越大
C 顺式异构体的荧光效率大于反式异构体
D 共轭体系上的取代基不同，对荧光效率的影 响也不同
2. 一定的荧光效率
（一）跃迁类型
π→π*跃迁是产生荧光的最主要类型
（二）长共轭结构
λex λem φf
205nm 278nm 0.11
286nm 321nm 0.29
356nm 404nm 0.36
结论：π电子共轭程度越大，荧光强度（荧 光效率）越大，荧光波长长移
（三）分子的刚性和共平面性
C H2 芴φf 1.0
相对应
D 最长的荧光波长与最长的激发光波长相对应
（四）荧光效率和荧光寿命
分子产生荧光必须具备两个条件： 1. 强的紫外－可见吸收
2. 一定的荧光效率
（四）荧光效率和荧光寿命
荧光效率（荧光量子产率）
发射荧光的光子数 f 吸收激发光的光子数
φf 0～ 1
二、荧光与分子结构
分子产生荧光必须具备两个条件： 1. 强的紫外－可见吸收
O N Mg1/2
联苯φf 0.2
OH N
（三）分子的刚性和共平面性
CH3 SO3Na N CH3 CH3 SO3Na N CH3
H C C H C C
H H
结论：在相同的长共轭分子中，分子的刚性和共 平面性越强，荧光效率越大，荧光波长长移
（四）取代基效应
给电子基团
－NH2、 －OH、－OCH3、－NHR、－NR2荧 光效率提高、荧光波长长移 吸电子基团
F-λem
荧光光谱
nm
硫酸奎宁的激发光谱和荧光光谱
荧光光谱的特征
1、荧光光谱的形状与激发波长无关 产生原因： 荧光发射是从特定的激发态返回基态 荧光光谱的强度与激发波长有关
荧光光谱的特征
2、斯托克斯位移（Stokes shift）：λem ＞ λex 产生原因：能量损失 （1）内转换和振动驰豫
思考题
磺胺类药物的结构通式为，H2N
SO3H
试设计用仪器分析的方法分别测定磺胺原料药及人
体口服磺胺药片后血浆中药物含量。
第11章
荧光分析法
fluorometry
基本概念
第一激发单重态的最低振动能级
荧光：物质分子接受光子能量被激发后，从激发态
的最低振动能级返回基态时发射出的光。
荧光分析法：根据物质的荧光谱线位置及其强度
Fx F0 KCx
Fx F0 Cx Cs Fs F0
进行物质鉴定和含量测定的方法。
分子荧光分析法（molecular fluorometry）
第一节 荧光分析法的基本原理
能 量
自旋量子数s=1/2或-1/2 总自旋量子数 S＝0 多重性 2S＋1＝1
基态单重态
第一激发单重态
荧光和磷光产生示意图
无辐射跃迁
振动驰豫
处于激发态各振动能级的分子通过与溶剂分子的碰撞而将部 分振动能量传递给溶剂分子，其电子则返回到同一电子激发
态的最低振动能级的过程。
内部能量转换
当两个电子激发态之间的能量相差较小以至其振动能级有重叠 时，受激分子由高电子能级转移至低电子能级的过程。
荧光和磷光产生示意图
关于荧光
荧光的产生需经历两个过程：
吸收
发射 第一激发单重态的最低振动能级 振动驰豫 内部能量转换
例题
1. 所Fra Baidu bibliotek荧光，即某些物质经入射光照射后， 吸收了入射光的能量，从而辐射出比入射 光： A 波长长的光线 B 波长短的光线
第二节 荧光定量分析方法
Quantitative analysis of fluorometry
一、荧光强度与物质浓度的关系
I0 I
1. 观测方向:
与激发光源垂直
F
2. 原因: 消除透射光的影响
F K`(I0 I)
I I 0 10
ECl
(2.3ECl)2 ( 2.3ECl)3 F K `I 0[2.3ECl ] 2! 3!
3 酸度对荧光的影响
苯胺在下列哪种条件下荧光强度最强？ A pH＝1 B pH＝3
C pH＝13
D pH＝8
当荧光物质本身是弱酸或弱碱时，溶液的酸 度对荧光强度有较大影响，主要是因为在不同 酸度中分子和离子间的平衡的改变。
5 散射光对荧光的影响
散射光
瑞利光 拉曼光
选择适当的激发波长消除拉曼光 的干扰
三、影响荧光强度的外部因素
温度 溶剂 酸度 散射光 学习目的: 提高荧光分析的灵敏度和选择性
1 溶剂对荧光的影响
萘在下列哪种溶剂中的荧光强度最强？ A 1－氯丙烷 C 1－碘丙烷 B 1－溴丙烷 D 1，2－二氯丙烷
1. 一般情况下，荧光波长随着溶剂极性的增强而长移， 荧光强度也增强。 2. 原因: 在极性溶剂中， 的能量差小 * 跃迁