细胞生物学全套ppt课件

细胞融合/cell fusion：
在自然条件下或通过人工诱导的方法使两个或多个细胞融合成一个双核 或多核细胞的现象。 人工诱导细胞融合方法： 化学诱导：PEG; 病毒诱导：仙台病毒 ; 电融合技术
细胞拆合：
就是把细胞核与细胞质分离开来，然后把不同来源的细胞质和细胞核相 互结合，形成核质杂交细胞的过程。
免疫电镜源自文库术：
免疫电镜技术是免疫化学技术与电镜技术结合的产物，是在超微结构 水平研究和观察抗原、抗体结合定位的一种方法学。它是将抗体进行 特殊标记后用电子显微镜观察免疫反应的结果。 根据标记方法的不同， 分为免疫铁蛋白技术、免疫酶标技术和免疫胶 体金技术。
.
五）放射自显影技术/autoradiography：
细胞系（cell line）：
经第一代传代成功后，可顺利地传40-50代，且保持原来的染色体的二倍 体数量和接触抑制行为的传代细胞。
.
细胞工程：
应用细胞生物学和分子生物学原理和方法，通过某种工程学手段，在细 胞整体水平或细胞器水平上，依照人们的需要和设计来改变细胞内遗传 物质或获得细胞产品的一门综合科学技术。
主要内容
细胞结构与功能： 生物膜与细胞器的研究 细胞质膜、内膜系统、线粒体等 细胞骨架体系的研究 微丝、微管、中间纤维、Septin 细胞核、染色体 细胞连接与细胞外基质
细胞重要生命活动： 细胞增殖及其调控 细胞分化与肿瘤细胞 细胞凋亡
.
第一章 绪 论
细胞生物学概念:
细胞生物学是以细胞为研究对象, 从显微水平、亚显微水平、分子水平 等三个层次，以动态的观点, 研究细胞和细胞器的结构和功能、细胞的 起源与进化和各种生命活动规律的学科。
.
支原体是最小最简单的细胞，只有唯一的细胞器核糖体，直径 只有0.1-0.3μm。自然界中最小最简单的生命体是病毒。蓝细菌是已
知的世界上最古老的生命体 根据核酸类型不同，病毒可以分为两大类：DNA病毒、RNA病毒 根据宿主范围可分为: 动物病毒、植物病毒、细菌病毒（噬菌体）等。
一个细胞生存和增殖必须具备的结构装置与机能是： 1). 生物膜系统； 2). 遗传信息表达结构体系； 3). 细胞骨架系统。
转基因动物：
指以人工方法导入外源基因，在染色体内稳定整合并能遗传给后代的 一类动物。转基因动物是在胚胎和重组DNA技术发展的基础上产生的。 能在生物体中接近真实地再现某一特定基因的表达和所导致的后果， 把复杂系统简化进行研究，是目前层次最高的实验体系。
.
模式生物： 由于基因在进化上的保守性和遗传密码的通用性，从某一种生 物得到的有关基因性质或功能方面的信息往往也适用于其他生 物。因此，可利用一些个体较小、容易培养、操作简单、生长 繁殖快的生物来研究某一生物学问题，这类生物称为模式生物。 在进化上最接近于人的模式生物是小鼠。 在显微镜下通体透明的是线虫。 作为单细胞真核生物的代表，用于生物学研究的酵母主要有两 种：芽殖酵母和裂殖酵母。
概念： 利用核素的电离辐射使含AgBr或AgCl的乳胶感光的作用，对细胞内 生物大分子进行定性、定位与半定量研究，对细胞内生物大分子进 行动态和追踪研究，主要包含前体物掺入和放射显影两个步骤。
研究DNA、RNA、蛋白质在细胞中的代谢，常用的同位素标记物有： DNA: 3H标记的胸腺嘧啶脱氧核苷 RNA：3H标记的尿嘧啶核苷 Protein: 35S标记的甲硫氨酸和半胱氨酸，3H或14C标记的甲硫氨酸或 亮氨酸
• 真核细胞内部存在着由膜围绕构建的各种细胞器。细胞内的膜 系统与细胞膜统称为生物膜(biomembrane)，它们具有共同的 结构特征。
.
细胞质膜的基本功能
1、为细胞的生命活动提供相对稳定的内环境。 2、选择性的物质运输，包括代谢底物的输入与代谢产物的排出，其
中伴随着能量的传递。 3、提供细胞识别位点，并完成细胞内外信号跨膜传递。 4、为多种酶提供结合位点，使酶促反应高效而有序地进行。 5、介导细胞与细胞、细胞与基质之间的连接； 6、参与形成具有不同功能的细胞表面特化结构（膜骨架、鞭毛和纤
荧光漂白恢复技术： 以高能量激光束的照射使细胞特定区域的荧光发生不可逆的淬灭 （漂白），随后其它区域的荧光标记分子会运动到漂白区（恢复）， 可以用来检测活细胞表面或细胞内部分子的运动以及在各种结构上 分子动态变化率。
.
主要电镜制样技术：
超薄切片技术(ultrathin section) 分辨率5nm
.
单克隆抗体技术：
将一种来自于脾脏且产生抗 体的B淋巴细胞与小鼠骨髓瘤 细胞融合杂交，获得既能产 生抗体，又能无限增殖的杂 种细胞，经选择性培养后可 制备大量单克隆抗体的技术。
.
基因打靶：
又称为基因敲除, 是指从分子水平上将一个基因去除或替代, 然后从整 体观察实验动物,推测相应基因功能的实验方法。
.
速度沉降：分离 密度相近而大小 不等的细胞或细 胞器。
平衡沉降：分离 密度不等的颗粒。
.
速度沉降或平衡 沉降.
介质在离心管内 形成一连续或不 连续的密度梯度， 将细胞混悬液或 匀浆置于介质的 顶部，通过离心 力场的作用使细 胞分层、分离。
常用介质：氯化 铯、蔗糖、多聚 蔗糖。
二）细胞内物质显示方法：
.
三、细胞培养、细胞工程与显微操作技术：
原代培养(primary culture cell):
从机体取出后立即培养的细胞。一般传代不超过10代。
传代培养(subculture cell)：
适应在体外培养条件下持续培养的细胞。
细胞株（Cell Strain）:
通过选择法或克隆形成法从原代培养物或细胞系中获得具有特殊性质或 标志物的培养物，亦即由单细胞增殖形成的细胞群，称为细胞株。是具 有相同的遗传性状的细胞群体。
病理学家魏尔肖/Rudolf V.irchow进行补充。
细胞是生命活动的基本单位： 1. 一切有机体都是由细胞构成，细胞是生命体的基本构成单
位； 2. 细胞具有独立的、有序的自控代谢体系，细胞是代谢与功
能的基本单位； 3. 细胞是有机体生长与发育的基础； 4. 细胞是遗传的基本单位，细胞具有遗传的全能性； 5. 没有细胞就没有完整的生命。
.
冰冻蚀刻技术/Freeze etching：
首先用快速低温冷冻法将样品迅速冷冻，然后在低温下使相对脆弱部位断 裂，用铂、金等金属进行倾斜喷镀，再垂直于断面进行碳真空喷镀，形成 一层连续的碳膜，最后将样品本身消化，在电镜下观察碳膜和金属“铸 型”。冰冻蚀刻技术主要用于观察膜断裂面的蛋白质颗粒和膜面结构。 深度蚀刻主要用于观察胞质中的细胞骨架纤维及其结合蛋白。
原理：利用一些显色剂与所检测的物质中一些特殊基团特异 性结合或反应的特征，通过显色剂在细胞内的定位和颜色深 浅来判断某种物质在细胞中分布和含量。
.
三）细胞内特异核苷酸序列的定位与定性：
原位杂交技术（定义或原理）： 用带有标记的特定核酸分子作探针，通过分子杂交（碱基互补 配对原理）确定特殊核苷酸序列在染色体上或在细胞中的位置 的方法，称为原位杂交。在光镜水平，探针可用放射性核素或 荧光标记；在电镜水平，与免疫胶体金技术结合，探针可用生 物小分子标记。
负染技术(negative staining) 分辨率1.5nm
冰冻蚀刻技术(freeze etching) 快速冷冻深度蚀刻技术(quick freeze deep etching) 低温电镜技术(cryoelectron microscopy)
.
超薄切片：
电子束穿透力很弱，须将标本制成40-50nm（小于100nm）的超薄切片。 方法： 透射电镜观察的组织细胞样本在超薄切片之前常用戊二醛和四氧化锇 双重固定；丙酮逐渐脱水；环氧树脂包埋；切片；采用柠檬酸铅和醋 酸双氧铀等进行染色。 透射电镜的样品制备包括固定、脱水、包埋、切片、染色五个步骤。
.
四）特异性蛋白或抗原的定位与定性：
蛋白质分子定位最常用的研究技术：免疫荧光与免疫电镜技术。
免疫荧光技术：
将免疫学方法(抗原抗体特异结合)与荧光标记技术结合起来研究特异蛋 白抗原在细胞内分布的方法。先将已知的抗原或抗体标记上荧光素制 成荧光标记物，再用这种荧光抗体（或抗原）作为分子探针检查细胞 或组织内的相应抗原（或抗体）。在细胞或组织中形成的抗原抗体复 合物上含有荧光素。由于荧光素所发的荧光可在荧光显微镜下检出， 从而可对抗原进行细胞定位。
负染技术/negative staining ：
用重金属盐对铺展在载网上的样品染色，吸取多余染料，干燥后，使样品 凹陷处铺上一层重金属盐，从而出现负染效果，分辨率可达1.5nm左右。
植物叶绿 体内膜表 面结构
微丝负染
.
二、细胞组分的分析方法：
一）离心分离方法：
利用超速离心机对细胞组分进行分级分离的常用方法有： 差速离心法、密度梯度离心法。
.
第三章 细胞质膜
一、细胞质膜的概念与功能： 细胞膜(cell membrane) 定义：又称质膜(plasma membrane)，是指围绕在细胞最外层
，由脂质和蛋白质等组成的膜结构体系。 功能：细胞膜不仅是细胞结构上的边界，使细胞具有一个相对稳
定的内环境，同时在细胞与环境之间进行物质、能量的交换及 信息传递过程中也起着决定性的作用。
.
R = 0.61 λ/n Sinα= 0.61 λ/NA
分辨率: 指能分辨出的相邻两个质点间最小距离的能力，这种距离称为分辨距 离，它受到光衍射性质的限制。分辨率由光源的波长、物镜的镜口角、 介质折射率三种因素决定。 λ=照明光源的波长。 n=聚光镜和物镜之间介质的折射率。 α=样品对物镜角孔径的半角。
.
1000g, 10min 20000g, 20min
80000g, 1h 150000g, 3h
差速离心： 利用不同离心 速度所产生的不同离心力， 将亚细胞组分和各种颗粒进 行分开的方法。
密度梯度离心：利用各组分在 介质中的沉降系数不同，使各 组分形成区带。介质溶液是具 有密度梯度、高溶解性和化学 惰性的溶液。分为速度沉降和 等密度沉降两种，前者主要用 于分离密度相近而大小不一的 组分，后者用于分离不同密度 的细胞成分。
数值孔径(又叫镜口率) 是物镜和聚光镜聚光能力的主要技术参数，是 判断两者(尤其对物镜而言)性能高低的重要标志。 数值孔径越大，进入物镜的光越多；介质的折射率越大，则数值孔径 越大，这些都可以使分辨率提高。
放大率：最终成像的大小与原物体大小的比值。 对显微镜来说，最重要的性能参数是分辨率，而不是放大倍数。
细胞体积大小上限一般为数百微米，下限为100nm ，其决定因 素有： 1. 核质比； 2. 物质交流和运输的效率； 3. 体积表面积比。
.
.
第二章 细胞生物学研究方法
.
一、显微成像技术：
普通光学显微镜以可见光为光源，荧光显微镜的光源是以紫外 线为光源，而电子显微镜是以电子束为光源。 电子显微镜按工作原理和用途的不同可分为透射电镜和扫描电 镜。扫描电镜：观察样品表面的结构特征； 透射电镜：观察 样品的内部精细结构。
细胞学说的建立和内容:
一切生物体都是由细胞组成的； 细胞是生命的基本组成单位； 一切细胞只能来自原来的细胞(的分裂)
第一个利用显微镜观察细胞的人：英国人胡克/Robert Hooke 第一个利用显微镜观察到活细胞的人：荷兰学者列文虎克 /Leeuwenhoek 提出者：德国的植物学家施莱登/Schleiden、动物学家施旺/Schwann
.
荧光共振能量转移： 荧光共振能量转移是指两个荧光发色基团在足够靠近时，当供体分 子吸收一定频率的光子后被激发到更高的电子能态，在该电子回到 基态前，通过偶极子相互作用，实现了能量向邻近的受体分子转移 （即发生能量共振转移）。可用于研究活细胞生理条件下研究蛋白 质-蛋白质间相互作用及其发生的时空性。如果两个蛋白质分子的 距离在10nm之内，一般认为这两个蛋白质分子存在直接相互作用。
.
显微镜类型 分辨本领 光源 透镜
成像原理
光学显微镜 200nm 可见光 玻璃透镜 利用样本对光的吸收形成 明暗反差和颜色变化
电子显微镜 0.2nm 电子束 电磁透镜 利用样品对电子的散射和 投射形成明暗反差
荧光显微镜技术： （包括激光扫描共聚焦显微镜、超高分辨率
显微镜）
荧光显微镜技术包括免疫荧光技术和荧光素直接标记技术。