单克隆抗体

单克隆抗体技术

单克隆抗体的克隆化方法

经过抗体测定的阳性孔，可以扩大培养，进行克隆，以得到单个细胞的后代分泌单克隆抗体。克隆的时间一般说来越早越好。因为在这个时期各种杂交瘤细胞同时旺盛生长，互相争夺营养和空间，而产生指定抗体的细胞有被淹没和淘汰的可能。但克隆时间也不宜太早，太早细胞性状不稳定，数量少也易丢失。

克隆化的阳性杂交瘤细胞，经过一段时期培养之后，也还会因为细胞突变或特定染色体的丢失，使部分细胞丧失产生抗体的能力，所以需要再次或多次克隆化培养。克隆化次数的多少由分泌能力强弱和抗原的免疫性强弱而决定。一般说，免疫性强的抗原克隆次数可少一些，但至少要3～5次克隆才能稳定。

克隆化的方法很多，包括有限稀释法、显微操作法、软琼脂平板法及荧光激活分离法等。

（一）有限稀释法

1．材料

（1）微量培养盘，盘内各孔于克隆化前一天培养小鼠腹腔细胞（即饲养细胞）每孔2万～4万。

（2）HT培养基

2．操作方法

（1）取出抗体阳性孔细胞，用HT培养液制成细胞悬液。并取样进行台盼兰染色，计数。

（2）用HT培养液将细胞稀释成200个/ml、40个/ml、20个/ml和的悬液。

（3）用吸管将细胞悬液分别种入微量培养盘，每孔0.05ml，细胞含量分别为10个/孔、2个/孔、1个/孔和0.5个/孔。

（4）5％CO2饱和湿度，37℃培养。

（5）每天用倒置显微镜观察克隆生长情况，选择只有一个集落生长的孔，弃掉两个以上和没有细胞生长的孔。

（6）克隆大量繁殖后，布满孔底的1/3～1/2时，测培养液抗体。

（7）抗体阳性孔细胞，移到有饲养层的组织培养瓶中，并传2～4代就可以脱离饲养细胞，建成克隆株。（二）软琼脂克隆化

借助撒在软琼脂上单个细胞定位生长，而达到克隆化，具体操作如下：

1．配2.5％的琼脂糖30ml，水浴溶化后，移入45℃水浴中。

2．将117ml完全DMEM液和3ml 10倍浓度的DMEM液混合，置45℃水浴预热。

3．将琼脂糖与DMEM液混合，即为含0.5％琼脂糖的完全DMEM液，并加75×108 脾细胞。

4．每块平皿加10ml，于室温中凝固。

5．DMEM中的细胞与DMEM—琼脂1:1混合，将细胞琼脂混合物2ml铺于凝固的平板上，使其全部覆盖。

6．放入CO2箱饱和湿度，37℃培养10天。

7．用PBS配制0.6％琼脂糖，于沸水浴溶解后，置45℃，在保温情况下取一试管，迅速加入0.1ml 25％羊红血球，0.2ml豚鼠补体，2.7ml 0.6％琼脂糖。

8．用3ml琼脂糖—羊红血球混合液覆盖克隆。于37℃CO2箱孵育1h~2h。从克隆上部溶解羊红血球的溶血范围，可筛选抗羊红血球Ig。

（三）显微镜操作法

在直径6cm培养皿中，加入1ml 1.0×108细胞悬液放置5％CO2饱和湿度，37℃温箱中放置30min以上，倒置显微镜下，寻找那些与周围相距甚远的单个细胞，将毛细管口（一头有直角弯头毛细管，一头连接一尺长乳胶管，用口控制液体进入）水平置放于液面上，左右微动，直到看见管口，对准细胞，吸入毛细管，将管中细胞移到预先加有2.0×104~5.0×104饲养细胞96孔板内，培养后，即可获得单个细胞形成的克隆。

（四）荧光激活分离法

用一种荧光激活细胞分类器（Fluorescein Activafed Cell Sorter，FACS）。其基本原理是：将细胞经荧光抗体染色后，经喷嘴形成单个细胞的线形液滴，在莱塞光激发下，荧光素发射荧光，此信号由光电倍增管

接收，再结合细胞形态大小产生光散射信号，经电脑处理，产生信号并与预定的信号对比，根据细胞荧光强度及细胞大小不同，将细胞分成不同级别，在电场中发生偏离，而分别收集于不同容器中。

单克隆抗体的制备

（一）杂交瘤细胞的大量繁殖

克隆化的细胞可以在体外进行大量培养，收集上清液而获得大量的单一的克隆化抗体。不过体外培养法得到的单克隆抗体有限，其不能超过特定的细胞浓度，且每天要换培养液。而体内杂交瘤细胞繁殖可以克服这些限制。杂交瘤细胞具有从亲代淋巴细胞得来的肿瘤细胞的遗传特性。如接种到组织相容性的同系小鼠或不能排斥杂交瘤的小鼠（无胸腺的裸鼠），杂交瘤细胞就开始无限地繁殖，直至宿主死亡。产生肿瘤细胞的小鼠腹水和血清中含有大量的杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体，这种抗体的效价往往高于培养细胞上清液的100~1 000倍。

利用免疫抑制剂，如降植烷、液体石蜡、抗淋巴细胞血清等，可以加速和促进肿瘤的生长。

1．材料

（1）经高压灭菌的降植烷。

（2）Balb/c鼠：5~8周龄。

（3）杂交瘤细胞：取对数生长期的细胞。

（4）RPMI—1640培养液

（5）新生牛血清

2．操作方法

(1) 于小鼠腹腔注射0.5ml降植烷，注射后１～９周内种植细胞。

(2) 收取对数生长期的杂交瘤细胞，用５％FCS—1640液洗涤一次，1 000r/min离心10min。

(3) 取样，用台盼兰染色，计活细胞数，重新用５％FCS—1640液配成1.0×107细胞/ml的悬液。

(4) 给注射了降植烷的小白鼠接种杂交瘤细胞，每只腹腔注射1ml（含1.0×107个细胞/ml）。

(5) 接种后10天左右时间肿瘤体积最大，此时可由腹腔抽取腹水，每隔1~3天取1次，可取10次。血清可由腋下动脉或心脏采血后分离。

（二）单克隆抗体的提纯

1．材料

(1) 20mMol/L pH7.8~7.9Tris—HCl缓冲液

20 mMol/L NaCl

(2) 20mMol/L pH7.8~7.9Tris—HCl缓冲液

40mMol/L NaCl

(3) 20mMol/L pH7.8~7.9Tris—HCl缓冲液

80 mMol/L NaCl

(4) 20mMol/L pH7.8~7.9Tris—HCl缓冲液

(5) 饱和硫酸铵液

(6) DEAE—纤维素柱

2．操作方法

（1）小鼠腹水用冷PBS液稀释4倍后，于1.00×105转离心30min，去沉淀。

（2）在4℃于上清中缓缓滴加饱和硫酸铵液，边加边搅拌，使溶液最终为50％硫酸铵浓度。

（3）此溶液置冰中30min~60min，然后5 000r/min离心10min，去上清。

（4）将沉淀溶于Tris－HCl缓冲液（40mMol/L NaCl）中（溶液可能混浊）。

（5）装入透析袋于Tris－HCl缓冲液（20 mMol/L NaCl）中透析除盐。

（6）离心去沉淀。

（7）溶液稀释（1:100或更高倍稀释）后，于280nm测蛋白含量，估计蛋白质含量

1A 280unit=0.8mg蛋白质

一般每ml腹水中，含有总蛋白约25mg~36mg。