定量PCR技术详解(终点定量、实时定量)

定量PCR技术
①传统终点定量法：为终点定量，重现性差、误差较大，只能作半定量、粗略定量
缺点：1、传统定量方法都是终点检测，即PCR到达平台期后进行检测，而PCR经过对数期扩增到达平台期时，检测重现性极差，无法直接从终点产物量推算出起始模板量。

加入内标后，可部分消除终产物定量所造成的不准确性。

2、在待测样品中加入内标，则PCR反应变为双重PCR，双重PCR反应中存在两种模板之间的干扰和竞争，尤其当两种模板的
起始拷贝数相差比较大时，这种竞争会表现得更为显著，由于待测样品的起始拷贝数是未知的，所以无法加入合适数量
的已知模板作为内标。

方法：以看家基因为内参，通过目的基因与看家基因扩增产物的电泳条带的灰度、宽窄、光密度比值来确定待测目的基因的表达量。

内参基因（看家基因）：在细胞中的表达量或在基因组中拷贝数恒定，受环境因素影响较小，用于对样本初始浓度差异进行均一化校正，常用的有β-actin、GAPDH、18sRNA等。

1）内参照法：在不同的PCR反应管中加入已定量的内标和引物，内标用基因工程方法合成。

上游引物用荧光标记，下游引物不标记。

在模板扩增的同时，内标也被扩增。

在PCR产物中，由于内标与靶模板的长度不同，二者的扩增产物可用电泳或高效液相分离开来，分别测定其荧光强度，以内标为对照定量待检测模板。

2）竞争法：选择由突变克隆产生的含有一个新内切位点的外源竞争性模板。

在同一反应管中，待测样品与竞争模板用同一对引物同时扩增（其中一个引物为荧光标记）。

扩增后用内切酶消化PCR产物，竞争性模板的产物被酶解为两个片段，而待测模板不被酶切，可通过电泳或高效液相将两种产物分开，分别测定荧光强度，根据已知模板推测未知模板的起始拷贝数。

3）PCR-ELISA法：利用地高辛或生物素等标记引物，扩增产物被固相板上特异的探针所结合，再加入抗地高辛或生物素酶标抗体－辣根过氧化物酶结合物，最终酶使底物显色。

常规的PCR－ELISA法只是定性实验，若加入内标，作出标准曲线，也可实现定量检测目的。

②荧光实时定量法：为扩增期定量，重现性好、误差较小
SYBR GreenⅠ染料法
TaqMan Probe探针法
1、绝对定量：标准曲线
扩增曲线：荧光强度–循环数曲线→ Ct值
标准曲线：初始模板量对数– Ct值（呈线性相关）
数学基础：理想状态 X n = X0 × 2n
非理性状态：X n = X0（1 + Ex）n Ex代表扩增效率
→logX n = log（X0（1 + Ex）n）
→logX0 = （-log（1 + Ex））n + logX n
→logX0 = （-log（1 + Ex））n + logX Ct X ct为达Ct值时扩增量
方法：将已知浓度的相应DNA模板（标准品）梯度稀释，根据实时PCR得到相应的Ct值，构建标准曲线；同时，待测样品也进行PCR，得到未知浓度的待测样品的Ct值，再根据标准曲线得出其初始浓度。

标准品：a.含有和待测样品相同的扩增片段的克隆质粒
b.含有和待测样品相同的扩增片段的cDNA
c.纯化的待测样品PCR扩增产物
紫外分光光度计或荧光酶标测定标准样品浓度，根据质粒或cDNA分子量换算成拷贝数，作系列梯度稀释。

待测样品浓度 = OD260× 40 ×稀释倍数（ng/μl）
待测样品分子量 = 碱基数× 324
待测样品拷贝数 = 待测样品浓度/待测样品分子量× 6 × 1014
2、相对定量：引入管家基因，比较Ct 值得到相对量（差值或倍数），可用于基因表达差异性分析
两种样品：待测样品、对照样品（如正常组织）
两个基因：目的基因、管家基因（如β-actin 、GAPDH 、18sRNA ）
（1）双标准曲线法
方法：a.用目标基因和内标基因的标准品分别制作标准曲线
b.待测样品和对照样品同时扩增目的基因、内标基因，获得Ct 值
c.通过标准曲线计算目的基因、内标基因的绝对初始拷贝数
d.用内标基因对目标基因均一化
e.均一化后的目标基因值之比得出待测样品和对照样品中目的基因的表达差异
公式：校正值 = 目的基因定量值 / 管家基因定量值
相对值 = 待测样品校正值 / 对照样品校正值
优点：分析简单，实验优化相对简单
缺点：对每一个基因、每一轮试验都必需作标准曲线
（2）2-ΔΔCt 法
数学基础：PCR 反应方程 X n = X 0（1 + Ex ）n
X T = X 0（1 + Ex ）
Ct （M 目标基因、N 内标基因） 均一化：CtN N N0CtM M M0TN TM E 1X E 1X X X ）
（）（++= → CtM M CtN N N0M0E 1E 1X X ）（）（++= 优化实验条件E N = E M = 1
→ K 22X X Ct -CtN -CtM -N0
M0===∆）（ 样品2与样品1相比：Ct -1Ct -2
Ct -1222
2K K ∆∆∆∆== -ΔΔCt =（CtM2 - CtN2）-（CtM1 - CtN1） 优点：无需作标准曲线
缺点：假定扩增效率为100%，假定标准曲线和每次扩增间的效率都保持一致。