动物模型制备

实验动物学
肝纤维化动物模型制备
——原理及应用
肝纤维化动物模型制备
——原理及应用[摘要]肝纤维化是威胁人类健康的常见疾病，是各种慢性肝病最重要的病理基
础，也是原发性肝癌的发病危险因素之一。

它是肝损伤后的修复反应，涉及一系列复杂的分子及细胞机制，如何制备与人类肝纤维化相似的动物模型，不仅是深入研究肝纤维化及肝硬化发病机制的重要基础。

也是筛选防治药物的有效手段。

本文重点讨论制备大鼠纤维化动物模型的不同研究方法及原理。

并评述了CCL4模型的优缺点与应用范围。

不同造模方法制备的肝纤维化动物模型各具特点，选择最为合适的动物模型。

[关键词]: 肝纤维化; 肝硬化；动物模型;优缺点
肝纤维化是各种慢性肝病的共同病理过程，是向肝硬化发展的中间阶段。

制作和选择肝纤维化动物模型，是防治肝纤维化研究的基础之一。

肝纤维化研究是当今医学研究领域的热点难点之一,该病涉及到诸多复杂的致病因素及细胞功能和分子机制。

研究表明，肝纤维化这个阶段是可逆转的，因此，阻断肝纤维化已成为目前肝病研究的热点之一。

然而建立一个能反映人肝纤维化的动物模型一直是科学研究中的难点，建立一个能反映人肝纤维化的动物模型应该考虑到许多
方面，构建一种稳定、可复制、便捷和仿真性强的肝硬化动物模型是研究的必要条件。

近年来, 肝纤维化动物模型研究取得了可喜的进展。

现将目前常用的造模方法及其原理、特点与应用范围进行归纳。

综述如下。

1. 以 CCl4为主诱导的肝纤维化动物模型。

此法多用于研究肝纤维化发生机制、血清学标志物与组织病理的相关性及抗纤维化药物的筛选。

四氯化碳(ccl4)进入动物体内后，可直接进入肝细胞，经线粒体单加氧酶(P4502E1)系统代谢，代谢过程中产生三氯甲基和二氯甲基过氧化物。

这些自由基启动脂质过氧化反应，使细胞及细胞器膜性结构严重破坏，造成肝细胞变性、坏死。

长期给予ccl4可造成肝纤维化、肝硬化。

通过四氯化碳制备肝纤维化模型的途径有口服、腹腔注射、皮下注射。

其形成肝纤维化的时间依据大鼠种系、给药途径、用药剂量的不同而有差别。

1.1 单因素诱导性肝硬化模型
目前．单因素CCl4诱导制备CM的主要途径包括皮下注射、腹腔注射和口服灌胃等。

通常多采用30％～60％CCl。

油剂皮下注射的方法．剂量因动物种类而不同．一般小鼠为l一3 ml／kg(体重)。

大鼠为3～5 ml／kg，每周2次，通常12～15周即可成模。

该方法虽操作简便，但CCl4。

经皮下注射很快即被机体吸收进入循环系统。

脑、肾毒性较大。

注射位置易发生浸润性脓肿和溃疡。

死亡率可高达30％～40％。

CCL4腹腔内注射时，经门静脉系统吸收的浓度较皮下注射高，使肝硬化形成时间短，而较少的毒副反应使死亡率降至20％一35％日。

CCL4灌胃的吸收和代谢途径类似于腹腔注射．经门静脉系统进入肝实质，其刺激较少和生理模拟性更佳，用中等剂量。

CCL4制备小鼠CM时．灌胃诱导的速度优于腹腔注射．且二者在生存曲线上并无特异差别。

12～15周后，可以观察到大鼠一般状况：大鼠随着给药时间延长活动逐渐减少,精神萎糜,毛发蓬乱无光泽,常钻入垫；卷缩而卧,饮食量减少,至实验末时体重较原体重均有所增长；肝脏病理变化：大鼠肝脏明显肿大，肝包膜紧张，边缘钝，黄棕色，质硬。

切面可见岛状结节。

镜下大鼠肝脏小叶间结缔组织明显增多，出现由再生肝细胞形成的假小叶，其中有坏死细胞和气球样变细胞，中央静脉壁和汇管区的血管壁纤维有较明显的增生。

透射电镜显示，肝星形细胞内的脂滴明显减少，细胞周围大量胶原沉积，星形细胞周围有胶原纤维形成。

VON Gieson染色显示大量纤维间隔形成，纤维间隔分割包绕肝组织形成假小叶。

给药30 d 后,大鼠肝脏出现少量纤维组织生;60 d 时,所检大鼠中,有部分呈现少量至中等纤维组织增生;90 d 时,所检大鼠中会出现全部呈中等至大量纤维组织增生。

上述提示肝纤维化造模成功。

单因素CCl4诱导CM时．机制明确、效果肯定、重复性佳、剂量可控性强，常用于模拟暴发性肝功能衰竭、肝细胞脂肪样变所致的肝硬化．然而较高的死亡率和多器官毒副反应限制了其在肝纤维化和慢性肝硬化病理发展机制研究中的应用。

CCl4法的优点是：在病理生理学方面与人类肝纤维化和肝硬化的某些方面相类似，如-二者均有肝细胞坏死后的再生，肝硬化晚期纤维的浸润儿乎不可逆：肝纤维化病程进展和病变特征稳定，重复性好；具有造模简便、费用低廉、耗时短的优点。

此方法可应用于体内研究肝纤维化发生的细胞及分子机制、血清学标志物与组织病理的相关性以及抗纤维化药物的筛选。

缺点：对于相同的CCl4处理，肝纤维化的程度个体差异较大，而导致不一致的组织学利病理生理学表现。

CCl4
的肝毒性作用迅速而剧烈，若剂量掌握不当，死亡率很高；停止给药后，大鼠肝纤维化有自然恢复的倾向。

该模型的原始启动机制显然是毒性化学物质对肝脏的损伤作用, 比较适合药物性肝炎方面的研究, 但其能否准确反应病原微生物感染人体后导致肝纤维化的机理尚待进一步探讨。

1.2复合因素诱导性肝硬化模型。

鉴于单因素制备的周期长，成模比例低，有不少学者采用CC14复合因素致肝纤维化模型，此种模型可靠且复制时间短，肝纤维化进展稳定，适合于以引起肝细胞损伤为始动机制的肝硬化发生发展过程的动态研究。

此外，此模型可以观察到动物肝纤维化过程中糖、脂肪、蛋白质、色素等方面的代谢障碍，以及迅速出现的营养不良、脂肪变性、肝纤维等形态学改变。

① CC4+苯巴比妥联合造模：添加苯巴比妥可缩短造模时间，8一10周可形成肝硬化，但死亡率高达40％。

原理为苯巴比妥诱导肝内混合功能氧化酶，增加细胞色素P450活性，加速ccl4向CCl3，转化从而增加ccL4肝毒性。

方法为分别给大鼠口服CCL4,辅以苯巴比妥为唯一饮用水的方法建立肝纤维化动物模型，苯巴比妥的浓度分别采用0．05 mg／mL，其作用为诱导肝酶的活性，增加肝组织对ccL4的敏感性。

Krahenbuhl制备模型时,CCl4首次用量为O．05 mL／kg，以后每周2次，每次用量以前次用量引起体重变化减少6％。

9％为指标来决定，第5周时用量为(220±20)uL／只，第lO周为(220±40)uL／只，其建模时间10周时，结果显示肝脏表面可见结节形成．实质变致密，镜检可见在结节周围有少量纤维组织沉积，同时伴有脾大、慢性门脉高压表现。

添加乙醇能诱导P450活性从而增加ccl4的肝毒性，在乙醇的致肝脂肪变作用下使用ccl4能加速肝细胞坏死，造模时间明显缩短，同时可减小两者剂量以降低药物副反应与动物的不耐受现象。

吴盂超报道在小鼠使用该方法60d即可致成肝硬化．肝硬化稳定，分期明显，动物死亡率低。

②CCl4+乙醇复合高脂肪饮食为主诱导的肝硬化模型：用高脂低蛋白食物，30％酒精为唯一饮料，皮下注射CCL4,(第1次用5mL／kg，以后每隔3d皮下注射40％cCL4油剂(3mL／kg)，第6周末即可形成肝硬化。

该方法简单、成功率高(100％)，且死亡率低(20％)。

肝硬化形成后饲料中加入2％的氯化钠可制作肝硬化腹水模型。

ccL4,是复合因素中的决定因素，单纯玉米面仅能供给所需蛋白质的一半，并属于低胆碱饮食，饮酒可增加对胆碱的需求量，均可促进肝脂肪变性，使肝细胞对CCA 更敏感，这一模型目前已被广泛采用，具有简便易行、价廉及病变典型等优点。

该CM分期明确，在第l、2周以肝细胞变性坏死为主，第3、4周以弥漫性纤维增生为其特征，第5、6周，纤维间隔、结节与假小叶形成。

因其分期明显，该模型有助于研究外在因素对肝硬化进程的干预作用。

该方法用于小型动物较多，大型动物的尝试较少，与人肝炎肝硬化仍有差距。

有助于研究外在因素对肝硬化进程的干预作用。

该方法用于小型动物较多，大型动物的尝试较少，与人肝炎肝硬化仍有差距。

2.二甲基亚硝胺(DMN)法
DMN具有肝毒性、基因毒性和免疫毒性。

大鼠染毒后肝内小叶炎性细胞浸润，出血性坏死。

在肝内形成中心一中心纤维间隔或中心一门脉性纤维问隔。

George 等给大鼠腹腔每周注射DMNA三次，处理3周，结果17d即可见中心肝小叶坏死及嗜中性细胞浸润，21d可见胶原纤维沉积、局部脂肪变、胆管增生、中央静脉周围纤维沉积，此模型与人类肝硬化早期改变及胶原纤维沉积相似，可作为筛选抗纤维
化药物的方便模型。

王海燕等用SD大鼠按10 mg／kg的剂量，给予1％DMN生理盐水稀释液，腹腔注射10次，模型组大鼠均形成肝纤维化或早期肝硬化。

纤维化程度在2～4期之间。

该模型造模周期短，大鼠死亡率低，肝纤维化形成也相对稳定。

在评价药物对伴凝血障碍、纤溶亢进的慢性肝病致纤维化的防治方面是一个比较理想的模型。

缺点是小剂量不易形成肝纤维化，大剂量又容易形成肝细胞坏死后纤维化，剂量不容易掌握。

3.乙醇肝纤维化模型
通常慢性酒精中毒可引起肝脏的4种序贯性损伤．即脂肪肝、酒精性肝炎、酒精性肝纤维化和酒精性肝硬化。

肝脏是乙醇代谢的主要场所，乙醇的中间代谢产物乙醛是高度反应活性分子，能与蛋白质结合形成乙醛一蛋白加和物，后者不但对肝细胞有直接损伤作用，而且可以作为新抗原诱导细胞及体液免疫反应，导致肝细胞受免疫反应的攻击。

Tsul(amoto．French大鼠持续灌注法是较为通用的酒精性肝病造模方法。

酒精持续灌注的方法虽然先进且避免了给动物灌胃的麻烦，但是国内没有生产胃灌注装置，而国外的产品价格难以接
受，国内多采用灌胃法。

酒精引起肝纤维化的主要机制是酒精中间代谢产物乙醛对肝脏产生直接损害，其在肝脏使辅酶I(NAD)转变为还原性辅酶I(NADH)，从而其比值下降，而NDA／NADH比例下降使j致酸循环受抑制，进而脂肪氧化减弱，肝内脂肪酸合成增多。

当其增多超过肝脏的处理能力就形成脂肪肝，最终形成肝纤维化。

河福金等在大鼠常规喂养同时灌入酒精、橄榄油等的混合液．4周后可见肝小叶中央区明显坏死或呈局限性坏死、点状坏死，间质可见炎性浸润，电镜下可见肝细胞周围胶原纤维增生，此类模型依其处于不同的时期可作酒精性脂肪肝及肝纤维化的研究。

4. 血清免疫法建立肝硬化模型
造模方法是用异种血清或蛋白对大鼠进行皮下、腹腔或尾静脉注射。

人或牛血清白蛋白直接经静脉注射，可引起过敏性休克，动物死亡率较高，加用前列腺素El可以降低动物死亡率而不影响肝纤维化形成的时间和程度。

猪血清法操作简便，周期较短，成功率高，结果稳定，纤维化一旦出现不易改变，在研究肝纤维化产生机制和筛选抗纤维化药物方面有一定优势。

用异种血清制品建立肝硬化，其主要原理是异种的血清进入体内引发机体免疫应答反应，在肝脏主要是在肝脉汇管区形成免疫复合物沉积，由沉积的免疫复合物引起局部炎性反应，进一步刺激胶原增生而造成肝组织纤维化。

4. 1 异源血清法目前常使用的异种血清有牛血清，血吸虫血清、猪血清等。

其中牛血清白蛋白免疫损伤所致的肝纤维化，与临床上的慢性肝炎所致的肝纤维化在发病机制上更加接近。

这些免疫损伤性模型与人类肝纤维化形成近似，属主动性纤维化，符合人的肝炎后纤维化的形成机制，但因没有病毒持续复制和肝实质持续损伤的过程，与人肝纤维化相比仍有较大的差距。

4．2 人血清白蛋白法李培建等将人血清白蛋白用生理盐水稀释，用等量的不完全福氏佐剂乳化，每只大鼠皮下多点注射，每次注射白蛋白4 mg，共4次，然后尾静脉注射白蛋白进行免疫攻击。

该方法所造的动物模型肝细胞损伤较轻，无碎屑状或桥状坏死，有别于肝炎后肝硬化。

4. 3刀豆素蛋白A法小鼠经静脉注射植物凝集素刀豆素蛋白A(concanavalin
A，Con A)后，可以引起T细胞介导的急性肝损伤[26I。

李鸿立等将小鼠经尾静脉注射12．5 mg／kg剂量的1 mol／L刀豆素蛋白A，每周1次，连续6周。

与其他肝纤维化动物模型相比较，Con A诱导的肝纤维化模型的方法成功率较高，动物死亡率较低，方法简便易行。

5.胆汁淤积性肝纤维化
原理是通过切断胆管或注入硬化剂等方法人为地造成肝外胆道梗阻，从而引起梗阻部位以上肝管扩张、胆汁淤积，胆道内压力增高，并可引发肝内胆小管裂，胆汁中的胆红素和一部分胆汁酸可使线粒体受损，能量生成障碍、自由基产生、Ca+进入细胞内等，导致肝细胞的溶解、坏死。

国外文献报道，大鼠胆管内逆行性注入N一丁基一2一氰基丙烯酸盐加胆管结扎导致胆管阻塞，可建立胆管阻塞性纤维化模型。

胆管阻塞性肝纤维化模型ALT、AST、HA、LN均明显升高；病理组织学可见弥浸增生的胆小管，大量的胶原沉积在胆小管周围，肝细胞与增生的胆小管相比明显减少。

Shen等采用胆总管双重结扎的方法制备肿纤维化模型，即在肝管汇合处及胰管汇处的上方分别结扎，然后在两个线结间完全剪断胆总管。

4周时血清胆红素达到最高水平保持稳定，病理组织学检查发现，2周时可见胆管细胞增生，4周时月日管细胞增生更加明显，并伴有肝组织结构的变形，6周时肝内假小叶形成。

顾小红等在胆管结扎人鼠肝纤维化模型中成功分离培养肝星状细胞(HSC)，对丁研究肝纤维化形成中的关键环节一HSC的活化，增殖和胶原合成机制的研究提供了便利条件。

该模型的原理与发生在人体的继发性胆源性肝硬化的机制相吻合。

造模方法操作简单、周期短、阳性率高、自发逆转率低。

此模型的特点是在无炎症及坏死的情况下发生进行性肝纤维化, 与人类小结节性肝硬化的生化及组织学变化十分相似, 被认为是一种能模拟人肝纤维化比较理想的动物模型, 主要用于考察药物的直接抗纤维化作用及肝脏血液动力学研究。

该模型存在的问题造模动物胆汁过度淤积, 高死亡率, 以及胆管再通, 组织学发生逆转。

6. 肝纤维化动物模型展望
科研过程中选择一个与人类疾病特征相似的动物模型是最为重要的, 它是科研工作能否成功以及有无科研价值最起码的基础之一。

理想的肝纤维化模型病理改变呈阶段性，具有可逆与不可逆的阶段性演进过程，与人类疾病所致纤维化的形态特点一样，模型动物的表现符合中医“证”的特征，且造模方法简单，模型形成率高，重现性好。

因为肝纤维化的病因多样性、以及动物与人种属差异, 理想的肝纤维化动物模型的建立是临床研究和实验研究中的一个难点, 尚需进一步深入研究.迄今为止, 能完全反应人类肝纤维化的动物模型尚未完全取得成功。

这就要求科研工作者充分了解各种类型模型的特点,在前人实验基础上积极探索,寻找理想的肝硬化动物模型, 并在具体工作中充分考虑肝纤维化形成过程中的病因和机制、人与动物的物种差异、造模动物的自然恢复率等多种因素, 选择最为合适的动物模型。

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